崔婷，嚴玉晶，黃貴發(fā)，丁青，鐘志奎，劉燎原

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

百合為百合科植物百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulum Baker、細葉百合LiliumpumilumDC、卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉質(zhì)鱗葉，主要功效為養(yǎng)陰潤肺、清心安神[1]。百合主要化學成分為甾體皂苷類、酚類、生物堿類及其多糖類等[2-5]。現(xiàn)代藥理研究表明，百合有明顯的止咳祛痰、抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化等作用[6-9]。2015年版《中國藥典》僅規(guī)定了冷浸法下百合水溶性浸出物量、外觀性狀以及薄層鑒別等[10]，缺少指標成分含量的測定或特征圖譜等量化控制標準。因此，本研究擬采用HPLC法對百合浸出物提取方法及溶劑進行進一步的考察，結(jié)合百合浸出物指標成分含量及特征圖譜，優(yōu)選百合浸出物最佳提取工藝，為進一步完善百合浸出物的質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(Waters公司)；ME203E千分之一天平(Mettler Toledo公司，Max=220 g，d=0.001 g)；ME204E萬分之一天平(Mettler Toledo公司，Max=220 g，d=0.000 1 g)；XP26型百萬分之一電子天平(Mettler Toledo公司，Max=22 g，d=0.001 mg)；實驗室Milli-Q超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司)；TC-15套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)；HWS28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；DHG-9147A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 材料

王百合苷B(批號：114420-67-6，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度：98.0%)；百合藥材共12批，均為自采藥材，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉質(zhì)鱗葉，具體信息見表1。

表1 百合樣品信息Table 1 The information of Lilii Bulbus samples

1.3 試劑

乙醇(批號：SY21905018，分析純，西隴科學股份有限公司)；水為超純水；甲醇(批號：SY21905021，色譜純，默克股份有限公司)；乙腈(批號：SY21905022，色譜純，默克股份有限公司)；磷酸(批號：SY21903010，色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸出物提取方法的建立

2.1.1 熱浸法 取供試品S10約4 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，分別精密加入水和50%、75%、95%(體積分數(shù)，下同)乙醇各100 mL，按2015年版《中國藥典》通則2201項下浸出物測定法中的熱浸法提取，每組溶劑平行3份。

2.1.2 冷浸法 取供試品S10約4 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，分別精密加入水和50%、75%、95%乙醇各100 mL，按2015年版《中國藥典》通則2201項下浸出物測定法中的冷浸法提取，每組溶劑平行3份。

2.2 百合浸出物含量及特征圖譜測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18Column(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；檢測波長：205 nm；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，1%～15%A；4～8 min，15%～28%A；8～12 min，28%A；12～12.1 min，28%～1%A；12.1～20 min，1%A)。

2.2.2 對照品溶液的制備 取王百合苷B對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含王百合苷B為643.2 μg的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 浸出物：分別取“2.1.1”和“2.1.2”項下熱浸法和冷浸法續(xù)濾液，即為供試品溶液。藥材：取本品粉末約2 g，精密稱定，加入稀乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加入稀乙醇補足損失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取稀乙醇溶液，過0.22 μm濾膜，即為陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別吸取上述對照品溶液、藥材供試品溶液及陰性溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果顯示陰性對照溶液在王百合苷B位置無吸收，表明陰性對照溶液無干擾，見圖1。

圖1 對照品溶液(A)、陰性對照溶液(B)、供試品溶液(C)HPLC圖Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance (A),negative sample (B) and the sample (C)

2.3.2 標準曲線的制備 分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液各1 mL，置于2、5、10、25、50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度分別為321.6、128.6、64.32、25.73、12.86 μg/mL的系列對照品溶液。分別精密吸取上述系列對照品溶液及對照品原溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣1 μL，記錄色譜峰面積。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程Y= 3 004.8X- 13 655，r=0.999 1，表明王百合苷B質(zhì)量濃度在12.86～643.1 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗 日內(nèi)精密度：吸取“2.2.3”項下同一藥材供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以王百合苷B色譜峰為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值，結(jié)果相對保留時間的RSD均小于0.2%，相對峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。日間精密度：吸取“2.2.3”項下同一藥材供試品溶液，分別在不同日期內(nèi)按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，以王百合苷B色譜峰為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值，結(jié)果相對保留時間的RSD均小于0.1%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.3”項下同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12 h測定，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.2%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 按“2.2.3”項下方法平行制備同一供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD值均小于0.1%，相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明方法重復性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取百合藥材樣品(王百合苷B質(zhì)量分數(shù)為1.960 mg/g)9份，每份約1 g，精密稱定，按供試品中指標成分量與加入對照品量之比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5原則分別加入適量的王百合苷B對照品，按“2.2.3”項藥材制樣方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項的色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2?？梢?，王百合苷B的平均回收率為97.36%，RSD值為1.70%，表明方法回收率較好。

表2 王百合苷B加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 The Recovery results of regaloside B

2.4 不同提取溶劑及提取方法對浸出物量的影響

按2015年版《中國藥典》通則2201項下浸出物測定方法，分別精密量取“2.1”項下不同提取方法及不同提取溶劑下樣品溶液25 mL置蒸發(fā)皿中，水浴鍋蒸干后，于105 ℃條件下烘3 h，稱定干燥品質(zhì)量，以干燥品計算供試品中得到的浸出物量(%)，浸出物量=干燥品量/取樣體積×總體積/樣品取樣量×100%，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，熱浸法下，不同溶劑提取的百合浸出物的量均高于冷浸法，浸出物量順序為水>50%乙醇>75%乙醇>95%乙醇。

表3 不同提取溶劑及提取方法對浸出物量的影響Table 3 The extract amount of Lilii Bulbus in different extraction methods and solvents(n=3) w/%

2.5 不同提取溶劑及提取方法對王百合苷B質(zhì)量分數(shù)的影響

分別取“2.2.3”項下浸出物的供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件對百合不同提取方法、不同提取溶劑下浸出物中指標成分王百合苷B質(zhì)量分數(shù)進行測定，按干燥品計算浸出物中王百合苷B質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 不同提取溶劑及提取方法對王百合苷B質(zhì)量分數(shù)的影響Table 4 The content of regaloside B in different extraction methods and solvents(n=3) w/%

結(jié)果表明，提取溶劑為50%乙醇、75%乙醇時，提取方式對浸出物中王百合苷B質(zhì)量分數(shù)無明顯影響，以水和95%乙醇為提取溶劑時，熱浸法優(yōu)于冷浸法。

2.6 不同提取溶劑及提取方法對浸出物特征圖譜的影響

分別取“2.2.3”項下浸出物的供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜方法對百合不同提取方法、不同提取溶劑下浸出物的特征圖譜進行測定，記錄各共有峰面積，計算共有峰總面積結(jié)果見表5，色譜圖見圖2?？梢?，不同提取方法及提取溶劑下，主要特征峰基本一致，但共有峰總面積存在較大的差異，熱浸法共有峰總面積基本高于冷浸法，提取溶劑為95%乙醇時，共有峰峰2無法測出。

表5 不同提取溶劑及提取方法對浸出物特征圖譜的影響(n=3)Table 5 The area of common peaks of the characteristic spectrum in different extraction methods and solvents

圖2 不同提取溶劑及提取方法百合浸出物的HPLC圖Figure 2 The HPLC of Lilii Bulbus extract in different extraction methods and solvents

2.7 百合浸出物提取方法評價

由于百合中含有較多的淀粉、糖及黏液質(zhì)，樣品過濾時會影響過濾速度，從而對不同提取方法及提取溶劑結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，因此，本研究以浸出物量、指標成分含量、特征圖譜共有峰總面積、過濾速度作為評價指標，總分5分，并按照以上指標依次打分，最高5分，最低1分，按照系數(shù)0.3∶0.3∶0.2∶0.2計算不同提取方法及提取溶劑下的綜合分。加權(quán)總分=浸出物得分×0.3+含量得分×0.3+共有峰總面積得分×0.2+過濾速度得分×0.2，結(jié)果見表6。

表6 綜合得分評價表Table 6 The evaluation table of comprehensive scores

加權(quán)計算結(jié)果顯示，熱浸法75%乙醇得分最高，故選定百合浸出物提取方法為：熱浸法，以75%乙醇作提取溶劑。

2.8 百合浸出物質(zhì)量標準的建立

按以上得出的最佳提取溶劑及提取方式，即熱浸法、以75%乙醇為溶劑，對“1.2”項下各批次百合藥材進行浸出物測定，采用SPSS26.0軟件對12批不同產(chǎn)地浸出物測定結(jié)果進行差異性分析，結(jié)果見表7、圖3。

表7 不同產(chǎn)地百合各個指標測定結(jié)果(n=2)Table 7 The various indicators results of Lilii Bulbus from different origins

圖3 不同產(chǎn)地百合各指標對比分析圖Figure 3 The charts of comparative analysis of Lilii Bulbus from different origins

可見，上述12批不同產(chǎn)地百合間的藥材王百合苷B質(zhì)量分數(shù)、醇溶性浸出物量、浸出物中王百合苷B質(zhì)量分數(shù)及浸出物特征圖譜共有峰面積的差異無統(tǒng)計學意義，12批百合藥材浸出物量波動范圍為8.62%～11.62%，均值為10.03%，醇溶性浸出物中王百合苷B質(zhì)量分數(shù)波動范圍為1.492%～2.408%，均值為2.102%，表明上述4個不同產(chǎn)地百合質(zhì)量較均一、穩(wěn)定?？紤]到藥材取樣的代表性與質(zhì)量的波動性及制定標準的廣泛適用性，在制定百合醇溶性浸出物量及浸出物中王百合苷B質(zhì)量分數(shù)時以平均值下浮30%確定百合醇溶性浸出物不低于7.0%，浸出物中王百合苷B質(zhì)量分數(shù)不低于1.471%。

3 討論

百合是一種藥食同源的中藥，資源豐富，文獻研究表明百合主要化學成分為甾體皂苷類、多糖類、生物堿類、黃酮類、氨基酸及磷脂等，主要成分為甾體皂苷及多糖類等大極性成分[2-5]。2015年版《中國藥典》收載百合的鑒別項目為冷浸法下以水為溶劑進行浸出物測定，但百合中含糖類及黏液質(zhì)較多，冷浸后，溶液黏性較大，難過濾，需進行抽濾操作，且在過濾過程中損耗較大。浸出物測定過程中，浸出物量反映了藥材提取程度，指標成分含量及特征圖譜可以很好地反映藥材提取過程中量和質(zhì)的變化，故本研究以水及不同體積分數(shù)乙醇為溶劑進行考察，以浸出物量、浸出物中王百合苷B質(zhì)量分數(shù)、HPLC圖譜特征峰總面積、溶液過濾速度作為綜合評價指標優(yōu)選百合浸出物最佳提取工藝，結(jié)果顯示，以熱浸法下75%乙醇為溶劑，加權(quán)評分最高，宜作為百合醇溶性浸出物的提取溶劑及方法。

本研究按優(yōu)選的提取方法對不同產(chǎn)地的12批百合藥材的浸出物量、浸出物中指標成分王百合苷B質(zhì)量分數(shù)及特征圖譜進行測定，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地百合浸出物質(zhì)量整體較穩(wěn)定，無明顯差異。本研究建立的百合藥材浸出物及特征圖譜測定方法，為百合藥材質(zhì)量的控制提供有益的參考依據(jù)，并對百合浸出物質(zhì)量標準的建立提供了數(shù)據(jù)支持。