郭淦平,吳遠(yuǎn)軍*,姬艷麗,李見(jiàn)群,吳樹(shù)杰,溫妙珍

(1.東莞市婦幼保健院 輸血科，廣東 東莞523120；2.廣州血液中心臨床輸血研究所，廣東 廣州510095)

類孟買(mǎi)血型是由于位于19q13.3的FUT1 基因突變，導(dǎo)致H抗原合成障礙，表現(xiàn)為紅細(xì)胞H抗原部分缺失的一種罕見(jiàn)血型。類孟買(mǎi)血型個(gè)體血漿中可存在抗-H，不相容輸血可能引起溶血性輸血不良反應(yīng)，因此準(zhǔn)確鑒定類孟買(mǎi)血型具有重要的臨床意義。我們對(duì)常規(guī)ABO血型鑒定中遇到的1例ABO血型正反定型不相符的就診者，通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)和PCR-SSP 法FUT1基因測(cè)序證實(shí)其為類孟買(mǎi)血型OHmA，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

就診者，女，24歲，停經(jīng)1個(gè)半月，自測(cè)絨毛膜促性腺激素(HCG)陽(yáng)性，就診要求終止妊娠。B超提示宮內(nèi)早孕。在常規(guī)ABO血型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)正反定型不符，而進(jìn)行ABO、H和Lewis血型鑒定相關(guān)的血清學(xué)試驗(yàn)，并進(jìn)行PCR-SSP 法FUT1基因測(cè)序。

1.2 儀器與試劑

血型血清學(xué)專用離心機(jī)(KUBOTA，KA2200)，單克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-Lea、抗-Leb和A、B、O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn))，單克隆抗-AB，抗-H(LORNE 實(shí)驗(yàn)室有限公司生產(chǎn))。

1.3 方法

1.3.1用單克隆抗體試劑和標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞血型抗原和抗體 取試管12支，分別標(biāo)識(shí)為“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-H(對(duì)照)”、“抗-Lea”、“抗-Leb”、“Ac”、“Bc”、“Oc”、“自身c”；在標(biāo)識(shí)為“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-H對(duì)照”、“抗-Lea”、“抗-Leb”的8支試管中分別加入相應(yīng)單克隆抗體試劑100 μl，在標(biāo)識(shí)為“Ac”、“Bc”、“Oc”、“自身c”的4支試管中分別加入受檢者血漿100 μl；再在標(biāo)識(shí)為“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-Lea”、“抗-Leb”的7支試管中各加入濃度為3%-5%的受檢者紅細(xì)胞懸液50 μl，在標(biāo)識(shí)為“抗-H對(duì)照”的試管中加入濃度為3%-5%的O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液50 μl，在標(biāo)識(shí)為“Ac”、“Bc”、“Oc”的3支試管中分別加入濃度為3%-5%的A、B、O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液50 μl，在標(biāo)識(shí)為“自身c”的試管中加入濃度為3%-5%受檢者紅細(xì)胞懸液50 μl。將12支試管內(nèi)反應(yīng)物混勻后，用血型血清學(xué)專用離心機(jī)120 g離心1 min，肉眼和顯微鏡下觀察凝集情況。

1.3.2吸收放散試驗(yàn)檢測(cè)紅細(xì)胞弱表達(dá)的ABO血型抗原 取5人份B型血漿(各1 ml)混合后吸取2 ml，與受檢者壓積紅細(xì)胞1 ml混合，置于4℃吸收4 h(每30 min混勻一次)，離心分離上清液，將壓積紅細(xì)胞用4℃生理鹽水連續(xù)洗滌4次，留取最后一次洗滌液與A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)以判定洗滌效果。在洗滌后的壓積紅細(xì)胞中加等容量生理鹽水，置56℃放散10 min，56℃保溫離心后吸取上清液(放散液)。取試管4支，分別標(biāo)識(shí)為“放+Ac”、“放+Bc”、“放+Oc”、“洗+Ac”，在標(biāo)識(shí)為“放+Ac”、“放+Bc”、“放+Oc”的3支試管中各加入放散液100 μl，并分別加入濃度為3%-5%的A、B、O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液50 μl；在標(biāo)識(shí)為“洗+Ac”的試管中加入最后一次洗液100 μl和濃度為3%-5%的A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液50 μl。將4支試管內(nèi)反應(yīng)物混勻后用血型血清學(xué)專用離心機(jī)120 g離心1 min，肉眼和顯微鏡下觀察凝集情況。

1.3.3FUT1基因測(cè)序 采用PCR方法擴(kuò)增FUT1基因的編碼區(qū)域全長(zhǎng)，擴(kuò)增引物、體系及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送專業(yè)的生物技術(shù)公司進(jìn)行后續(xù)純化和Sanger測(cè)序(廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司，廣州)。測(cè)序結(jié)果用DNASTAR軟件與FUT1基因標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_000019.9)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)堿基變異進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體試劑和標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞血型抗原和抗體結(jié)果

受檢者紅細(xì)胞與單克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-Lea、抗-H反應(yīng)均為陰性，與單克隆抗-Leb反應(yīng)為3+，O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞與單克隆抗-H反應(yīng)(陽(yáng)性對(duì)照)為2+；受檢血漿與A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)為±，與B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)為4+，與O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)為1+，表明受檢者血漿中存在較強(qiáng)的抗-B和較弱的抗-H，見(jiàn)表1。

表1 單克隆抗體試劑和標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞血型抗原和抗體結(jié)果

2.2 吸收放散試驗(yàn)結(jié)果

受檢者紅細(xì)胞與B型人血漿的吸收放散液，與A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)為1+，與B型和O標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。最后一次洗滌液與A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性，表明受檢者紅細(xì)胞弱表達(dá)A抗原，不表達(dá)B抗原，見(jiàn)表2。

表2 吸收放散液檢測(cè)結(jié)果

2.3FUT1基因測(cè)序結(jié)果

FUT1基因測(cè)序檢出c.658C>T純合突變(以往將攜帶有該突變的等位基因命名為h3等位基因，即本例樣本基因型為h3h3)。該突變導(dǎo)致FUT1編碼的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶第220位精氨酸(Arg)突變?yōu)榻z氨酸(Cys)，即 p.220Arg>Cys，見(jiàn)圖1。

圖1 FUT1基因測(cè)序結(jié)果

3 討論

紅細(xì)胞H抗原是國(guó)際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)確認(rèn)并編號(hào)為018的紅細(xì)胞H血型系統(tǒng)中唯一的抗原。ABH血型物質(zhì)的表達(dá)與ABO、H、Lewis血型系統(tǒng)密切相關(guān)，前體物質(zhì)都是多糖R，受ABO、FUT1(H)、FUT3(LE)、FUT2(Se)這4個(gè)座位基因控制，ABO、FUT1、FUT3、FUT2的基因產(chǎn)物都是糖基轉(zhuǎn)移酶。ABO編碼A、B糖基轉(zhuǎn)移酶，控制ABO血型系統(tǒng)抗原表達(dá)；FUT1編碼α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，控制H抗原表達(dá)；FUT3編碼Lewis轉(zhuǎn)移酶，控制Lewis血型系統(tǒng)抗原表達(dá)；FUT2 控制ABH分泌型，其Se為ABH分泌型，se為ABH非分泌型，SeW為ABH部分分泌型[2]。

FUT1基因有兩個(gè)等位基因H和h，H等位基因編碼的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶使巖藻糖與前身物質(zhì)多糖R糖鏈末端的半乳糖相連形成H抗原。而H抗原又是A、B抗原的前身物質(zhì)，在A、B基因編碼的A、B糖基轉(zhuǎn)移酶作用下分別轉(zhuǎn)化為A、B血型抗原。h等位基因不能編碼具有活性的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，hh純合子個(gè)體紅細(xì)胞上和分泌液中均無(wú)H、A、B抗原，血漿中有抗-H，是非常罕見(jiàn)的孟買(mǎi)血型(Bombay)。當(dāng)FUT1基因缺陷而FUT2基因正?；蛉醣磉_(dá)時(shí)可表現(xiàn)為紅細(xì)胞上具有很少量或沒(méi)有H、A、B抗原，分泌液中含有正常量的H、A、B血型物質(zhì)，即為類孟買(mǎi)血型(Para-Bombay)。類孟買(mǎi)型個(gè)體血漿中也可存在抗-H[3]。目前報(bào)道的與H抗原缺陷相關(guān)的FUTl等位基因有50余種[4]，在我國(guó)最常見(jiàn)的是h1、h2和h3等位基因，突變點(diǎn)分別是FUTI547delAG、FUTl880delTT和FUTl658C>T[5,6]。

現(xiàn)已明確，紅細(xì)胞不能合成Lewis血型系統(tǒng)的Lea和Leb抗原，紅細(xì)胞膜的Lea和Leb抗原是從血漿中吸附的Lea和Leb血型物質(zhì)，而血漿中的Lea受FUT3(LE)控制，Leb受LE和Se(分泌基因)共同控制。由于ABH分泌型個(gè)體FUT2基因型為Se/Se或Se/se，Lewis血型表現(xiàn)為L(zhǎng)e(a-b+)或Le(a-b-)，而不會(huì)表現(xiàn)為L(zhǎng)e(a+b-)[7]。

本例就診者紅細(xì)胞與單克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H反應(yīng)均為陰性，血漿與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)的凝集強(qiáng)度分別為A型±、B型4+、O型1+，紅細(xì)胞吸收放散液(與B型人血漿做吸收試驗(yàn))與標(biāo)準(zhǔn)A型紅細(xì)胞反應(yīng)為+，與B型和O型紅細(xì)胞反應(yīng)均為陰性，Lewis血型為L(zhǎng)e(a-b+)，符合類孟買(mǎi)血型OHmA(紅細(xì)胞未檢出H、B抗原，檢出弱表達(dá)的A抗原，血漿中檢出較弱抗-H和較強(qiáng)抗-B，根據(jù)Lewis血型可推測(cè)其為分泌型)。FUT1基因測(cè)序檢出我國(guó)常見(jiàn)的c.658C >T純合突變，從分子水平證實(shí)本例就診者為類孟買(mǎi)血型。

類孟買(mǎi)血型個(gè)體血漿中可存在抗-H，并由于作為ABO血型抗原前體物質(zhì)的H抗原缺陷，導(dǎo)致正常A、B基因的個(gè)體紅細(xì)胞不能表達(dá)正常的A、B抗原。從而導(dǎo)致ABO血型鑒定正定型紅細(xì)胞與單克隆抗-A、抗-B反應(yīng)無(wú)凝集，反定型可由于抗-H的存在而與A、B型紅細(xì)胞凝集(凝集強(qiáng)度一般較正常O型人弱)，表現(xiàn)為類似O型的反應(yīng)格局，容易將類孟買(mǎi)血型誤定為“O”型。如類孟買(mǎi)血型個(gè)體血漿不存在抗-H，則ABO血型鑒定表現(xiàn)為正反定型反應(yīng)格局不相符。因此，在常規(guī)鑒定ABO血型時(shí)應(yīng)采用正反定型，反定型應(yīng)使受檢者血漿(血清)與A、B、O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)正定型紅細(xì)胞與單克隆抗-A、抗-B反應(yīng)無(wú)凝集，正反定型不符或反定型與O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞有凝集者(先排除抗-H以外的紅細(xì)胞不規(guī)則抗體)，應(yīng)進(jìn)行類孟買(mǎi)血型的血清學(xué)鑒定，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行FUT1基因測(cè)序，以避免漏檢類孟買(mǎi)血型。

抗-H是具有臨床意義的紅細(xì)胞抗體，不相容輸血可引起免疫溶血性輸血反應(yīng)，通常認(rèn)為類孟買(mǎi)血型患者在需要輸血時(shí)最好輸用相同H抗原缺乏血型的血液[8]。但由于類孟買(mǎi)血型是非常稀有的血型，其頻率在不同人群中存在差異，泰國(guó)為1/5 000，臺(tái)灣為1/8 000，香港為1/15 620，我國(guó)大陸目前還沒(méi)有進(jìn)行大量樣本的調(diào)查，僅在某些地區(qū)和民族較高，如福建地區(qū)頻率約為1/8 500，而云南少數(shù)民族拉祜族中的頻率高達(dá)2.2%[9]。當(dāng)臨床發(fā)現(xiàn)類孟買(mǎi)血型患者需要輸血治療時(shí)很難找到相合供者，對(duì)其家系，尤其是同胞兄妹間進(jìn)行血型血清學(xué)調(diào)查，是尋找相合供者的重要途徑。在無(wú)法找到相同H抗原缺乏血型血液時(shí),應(yīng)根據(jù)血型血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)患者抗-A、抗-B、抗-H 的實(shí)際情況，選擇37℃與患者血清反應(yīng)最弱的ABO 血型進(jìn)行輸血治療[8,10-12]。