于艷華，王 穎，代芳芳，黃曉婕，婁金麗*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 1.臨床檢驗(yàn)中心；2.臨床感染中心，北京100069)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于很多原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期導(dǎo)致患者的預(yù)后普遍較差。因此，早期發(fā)現(xiàn)治療是良好療效的關(guān)鍵[1]。多數(shù)原發(fā)性肝細(xì)胞癌早期無(wú)癥狀,使得早期診斷變得困難。分子生物技術(shù)的發(fā)展確定了許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物標(biāo)志物。甲胎蛋白(AFP)是臨床應(yīng)用中最常用的血清學(xué)生物標(biāo)志物，但由于敏感性和特異性較低，臨床診斷AFP的準(zhǔn)確性不理想，迫切需要更具特異性生物標(biāo)志物[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)了其他可能用于早期檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物，包括高爾基體蛋白-73(GP73)、microRNA(miR)等等。然而，血清標(biāo)志物單獨(dú)檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的敏感性和特異性較低[3]。在本研究中，我們探討了聯(lián)合AFP、GP73和miR-221檢測(cè)作為血清生物標(biāo)志物來(lái)提高原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2019年9月-2019年12月間確診的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者50例(肝癌組),男性患者36例，女性14例；中位年齡53歲；肝硬化組50例，男性39例，女性11例，中位年齡55歲。對(duì)照組50例患者中，男31例，女19例，中位年齡50歲。

1.2 樣本采集

外周血 3-4 ml在室溫下離心 1 300×g 20 min，抽取上層透明微黃的血漿 0.5 ml，加入等量的(0.5 ml)樣本保存液中，標(biāo)本存于-80℃冰箱待測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1GP73采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，試劑盒由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供。取出試劑盒和待測(cè)樣本，在室溫(18-28 ℃)平衡至少30 min。分別在相應(yīng)孔中加入50 μl校準(zhǔn)品(S0-S7)和血清樣本(空白孔不加)，充分振蕩混勻30 s。用封板膜封板后37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌6遍，每次每孔應(yīng)加入至少300 μl洗滌液，最后一遍洗滌后在干凈吸水紙上扣干每孔加入100 μl酶結(jié)合物(空白孔不加)，振蕩混勻30 s。用封板膜封板后37 ℃溫育30 min。再次用洗板機(jī)洗滌6遍每孔加入單組份TMB顯色液100 μl，振蕩30 s，用封板膜封板后37 ℃避光溫育10 min。每孔加入50 μl終止液，振蕩混勻30 s，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度值(OD值)。酶標(biāo)儀無(wú)需空白孔調(diào)零點(diǎn)。需在終止反應(yīng)后10 min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。GP73>3.65 ng/ml為陽(yáng)性。

1.3.2RT-PCR分析miR-221的表達(dá)，試劑盒由駿實(shí)生物科技(上海)有限公司提供。Trizol 法提取血清中的RNA在擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)，使用混勻儀將 RP 板 1 200 rpm 混勻 15 秒，然后低速離心 15 s。放入熱循環(huán)儀，按照以下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在放入熱循環(huán)儀前，始終保持反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和 RP 板在 2-8℃。在擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)，吸移 75 μl的稀釋緩沖液到每個(gè) RP 板反應(yīng)孔內(nèi)，稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使用移液器輕輕吹打 10 次使徹底混勻，注意避免氣泡。在 PCR 板(PP)的相應(yīng)反應(yīng)孔里加入 9 μl稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。加樣完畢后，用封板膜密封 PCR 板(PP)，在混勻儀上以 1 200 rpm 混勻15 s，然后低速離心15 s。放入 PCR 熱循環(huán)儀，啟動(dòng)程序。miR-221相對(duì)值>3.0為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AFP、GP73及miR-221比較

原發(fā)性肝細(xì)胞癌組患者血清 AFP(陽(yáng)性參考值：>10 ng/ml、GP73及miR-221水平明顯高于肝硬化組和正常對(duì)照組，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，肝硬化組患者血清 AFP、GP73及miR-221水平與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3種血清標(biāo)志物在不同人群檢測(cè)結(jié)果的比較

2.2 AFP、GP73及miR-221單獨(dú)與聯(lián)合陽(yáng)性率比較

原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清AFP、GP73及miR-221陽(yáng)性率分別66%、64%、68%，聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率86%，明顯高于單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 血清學(xué)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率比較(例，%)

2.3 AFP、GP73及miR-221單獨(dú)與聯(lián)合特異性以及敏感性比較

血清AFP、GP73及miR-221聯(lián)合檢測(cè)敏感性為 86.0%，明顯高于各個(gè)血清標(biāo)記物單一檢測(cè)，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；但在特異性方面，3種血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)特異性為69%，低于AFP、GP73及miR-221 單項(xiàng)檢測(cè)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表3。

表3 三種標(biāo)志物單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)肝癌特異性及敏感性比較(%)

3 討論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療對(duì)改善患者預(yù)后有重要影響。然而，相當(dāng)多的肝癌患者在晚期才被確診，而此時(shí)治療方案也是有限的。臨床表現(xiàn)、影像、血清標(biāo)記物等方法是臨床診斷的重要依據(jù)。但是，目前臨床常用的血清標(biāo)記物AFP的敏感性和特異性不強(qiáng)[4]。作為肝癌的常規(guī)標(biāo)志物，AFP在腫瘤小于3 cm時(shí)常常檢測(cè)不到或表達(dá)水平較低。此外，肝炎肝硬化和慢性肝炎患者中也可以看到AFP水平的升高。因此，迫切需要尋找檢測(cè)能力更好的新的生物標(biāo)志物[5]。理想情況下，原發(fā)性肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物應(yīng)該是高度敏感的肝細(xì)胞癌與其他類(lèi)型的肝臟病變有區(qū)別，在早期高水平表達(dá)。在我們的研究中，血清AFP、GP73及miR-221聯(lián)合使用大大提高了原發(fā)性肝細(xì)胞癌的檢測(cè)能力。本研究證明，血清AFP、GP73 和miR-221聯(lián)合檢測(cè)作為診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物具有優(yōu)越性。

GP73又稱(chēng)高爾基體磷酸化蛋白2(GOLPH2)，是高爾基體跨膜蛋白，含400個(gè)氨基酸、分子量73kDa的糖蛋白。最近的一些研究表明GP73是最有希望的原發(fā)性肝細(xì)胞癌血清標(biāo)志物之一。盡管有研究報(bào)道GP73在早期原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷中的敏感性高于AFP(62%比25%)[6]。但GP73是否優(yōu)于AFP仍存在爭(zhēng)議，有研究表明,GP73是肝癌有價(jià)值的生物標(biāo)志物,并且在敏感性和特異性上優(yōu)于AFP[7]。他們還發(fā)現(xiàn)GP73和AFP聯(lián)合檢測(cè)可以進(jìn)一步提高敏感性。另一項(xiàng)meta分析發(fā)現(xiàn)[8]，GP73作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的獨(dú)立診斷標(biāo)志物，與AFP具有可比性。在我們的研究中，結(jié)果顯示GP73作為獨(dú)立的標(biāo)志物與AFP陽(yáng)性率及敏感性相似。

microRNA 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA。研究表明 microRNA 參與多種人體調(diào)節(jié)，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等。人的血漿中存在大量穩(wěn)定的 microRNA，并且大量研究揭示microRNA 與肝癌發(fā)病和預(yù)后等具有一定的相關(guān)性。與肝硬化、肝炎患者及健康人相比，肝癌患者血漿中的 miR-122、miR-21和miR-223 水平具有顯著的差異[9]，miR-221 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中會(huì)出現(xiàn)明顯上調(diào)的一類(lèi)microRNA，提示其可能與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生有相關(guān)性[10]。其他研究者的結(jié)果表明患者血清中 miR-221表達(dá)的改變與肝癌患者的生存率具有相關(guān)性[11]。這也是我們選擇 miR-221研究的原因。本研究顯示，AFP、GP73及miR-221 在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中的陽(yáng)性率分別為66%、64%、74%，而聯(lián)合檢測(cè)提升陽(yáng)性率達(dá)86%，敏感性明顯較單項(xiàng)檢測(cè)高。

綜上所述，我們的研究表明，聯(lián)合AFP、GP73及miR-221作為血清標(biāo)記物可以顯著提高原發(fā)性肝細(xì)胞癌的檢測(cè)能力，并且比單獨(dú)使用任何一個(gè)都具有更高的靈敏度，可能成為目前診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌的一個(gè)有價(jià)值的補(bǔ)充。對(duì)于原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床診斷具有非常重要的意義。