劉遠(yuǎn)興 周坤元 王士中 謝運泉 梁昊

急性缺血性腦卒中(急性腦梗死)是最常見的卒中類型，是由于腦部血管阻塞導(dǎo)致大腦缺血缺氧進而壞死[1]，占我國腦卒中的69.6%～70.8%[2]。急性期的時間劃分尚不統(tǒng)一，一般指發(fā)病后2周內(nèi)，輕型1周內(nèi)，重型1個月內(nèi)。我國住院急性缺血性腦卒中患者發(fā)病后1個月內(nèi)病死率約為2.3%～3.2%，3個月時病死率9.0%～9.6%，致死/殘疾率為34.5%～37.1%，1年病死率14.4%～15.4%，致死/殘疾率33.4%～33.8%[2]。腦卒中的發(fā)生，是先天和后天因素共同作用的結(jié)果，其中基因的表達非常關(guān)鍵。有多項研究表明Toll樣受體4(TLR4)表達與腦卒中的發(fā)生、發(fā)展存在顯著關(guān)聯(lián)[3-4]。rs10759932[5]和rs11536879[6]已證實與動脈粥樣硬化和冠心病存在明顯相關(guān)性。團隊前期也通過Meta分析得出TLR4基因多態(tài)性(SNP)位點rs10759932、rs11536891、rs11536879與缺血性腦卒中再灌注損傷的發(fā)生相關(guān)[7]。此外，不同人種中TLR4基因rs1927914位點上的T等位基因?qū)θ毖阅X卒中的易感性不同，歐美人種T等位基因高時，更易出現(xiàn)缺血性腦卒中，但對于亞洲人口這一結(jié)論尚缺乏有效證據(jù)[8]。為此，我們檢測梅州地區(qū)缺血性腦卒中患者和健康對照人群TLR4基因rs10759932、rs11536879、rs11536891、rs1927914 4個SNP位點的基因型，分析其與缺血性腦卒中的相關(guān)性，期望為腦卒中患者的防治提供臨床依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 觀察對象收集2018年1月1日至2018年7月31日在中山大學(xué)附屬梅州醫(yī)院(廣東省梅州市人民醫(yī)院)住院治療的梅州市籍貫首次突發(fā)缺血性腦卒中患者為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)癥狀、體查、CT/MRI影像學(xué)檢查等確診，符合腦卒中TOAST病因分型和《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[9]；(2)受試者或其監(jiān)護人同意簽署知情同意書；(3)患者籍貫為梅州地區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因外傷、心律失常、腦血管畸形、腫瘤、血液疾病引起的腦卒中患者，特別注意剔除大動脈粥樣硬化型與心源性栓塞造成的缺血性腦卒中患者；(2)患者無法配合或資料收集不全者。

收集同期在該院體檢中心的梅州市籍貫體檢健康者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)體檢確認(rèn)無腦卒中病史；(2)血壓、血糖、血常規(guī)、肝腎功能均正常；(3)受試者同意簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)體檢發(fā)現(xiàn)曾患有或正患有嚴(yán)重疾病，如心梗、心衰、癌癥等；(2)有精神病史；(3)阿爾茨海默病。

病例組共納入病例194例，剔除資料缺失5例、腦部腫瘤2例、DNA樣本不合格1例，共186例樣本進入研究，其中男127例、女59例，發(fā)病年齡37～86歲，平均(66.8±11.0)歲；對照組共收納入健康人202位，剔除資料缺失6位、患有其他心腦血管相關(guān)疾病2位，共194位健康樣本進入研究，其中男101例、女93例，發(fā)病年齡40～81歲，平均(64.6±19.1)歲。病例組和對照組在性別、發(fā)病年齡、吸煙史、飲酒史等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑及設(shè)備核酸自動提取儀(AU1001，BioTeKe Corpration)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher，USA)，Smart view pro 1100凝膠電泳成像儀、MP-300V 電泳儀(Major science)，ABI veriti-384 PCR儀(ABI)，384-well SpectroCHIP? bioarray芯片、MassARRAY Nanodispenser 點樣機(RS1000，BIT Group)、MassARRAY Analyzer 4.0質(zhì)譜儀(MA4.2，Agena)等。ddH2O(ABI)、擴增引物和延伸引物混合物(Thermo)，25 mmol/L dNTP混合物、HotStar Taq(5 U/μL)、SAP Buffer、SAP Enzyme、iPLEX Buffer Plus、iPLEX Termination mix及iPLEX Enzyme(Agena，Inc)。

1.3 方法

1.3.1樣品采集與準(zhǔn)備：納入研究的受試者均清晨空腹抽取5 mL靜脈全血，以乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，冷凍保存。檢測時，加入人紅細(xì)胞裂解液，劇烈震蕩 3 min，以12 000 r/min、離心半徑15 cm離心30 s，棄上清，沉淀獲取白細(xì)胞，提取血樣中的DNA。使用NanoDrop2000進行吸光度值檢測，1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，DNA質(zhì)檢合格(瓊脂糖電泳須有大于 10 kb 的明亮單一條帶，且無 RNA 和蛋白污染)，轉(zhuǎn)移至96孔板，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 4個TLR4 SNP位點引物序列

1.3.2基因分析：(1)引物設(shè)計及合成：在NCBI網(wǎng)頁(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中輸入4個SNP位點的名稱，按照dbSNP batch reportor格式顯示，并在My agena網(wǎng)站中獲取基因序列。結(jié)合公開發(fā)表過的關(guān)于該基因或該位點的文獻并采用 AssayDesigner3.1軟件進行引物設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴展引物(表1)，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

(2)基因分型檢測：對所有樣本的基因位點通過Agena MassArray系統(tǒng)進行基因分型檢測。首先進行PCR擴增反應(yīng)，繼而進行產(chǎn)物堿性磷酸酶處理，之后進行單堿基延伸反應(yīng)，最后進行樹脂純化和芯片點樣。將點樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用MassARRAY TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，經(jīng)兩人核對檢查數(shù)據(jù)文件的完整無誤(各SNP的數(shù)據(jù)不為空，質(zhì)譜無顯著干擾、缺失，能明確分型)后將結(jié)果保存。

1.3.3數(shù)據(jù)分析：(1)可靠性分析：利用MassARRAY TYPER4.0軟件根據(jù)DNA產(chǎn)物峰面積大小計算得到SNP位點所有分型點狀圖，正常聚類圖中2個純合子分型根據(jù)產(chǎn)物峰高分別在靠近橫、縱軸聚類，在二者之間單獨聚類的一組為雜合子，以此來確定SNP檢測的可靠性。

(2)群體代表性分析：計算各組TLR4的4個位點基因型頻率，經(jīng)Haploview 4.2軟件計算其是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡定律及最小等位基因頻率(MAF)，以H-W方法P值及MAF值均>0.05認(rèn)為符合群體代表性。

(3)回歸分析及相關(guān)性分析：將基因型、發(fā)病年齡、性別、吸煙史納入Logistic分析，確定基因型是否為危險因素。將病例組SNP基因型與發(fā)病年齡進行相關(guān)性分析，確定哪種基因型與發(fā)病年齡相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS21.0軟件進行分析。計量資料若符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；位點基因型資料以頻數(shù)表示，兩組間SNP表達差異比較采用χ2檢驗；采用二分類Logistic 回歸分析(經(jīng)年齡、性別、吸煙史、飲酒史校正)統(tǒng)計分析各SNP位點基因型與患病風(fēng)險的關(guān)系，計算值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)；以Spearman秩相關(guān)對SNP位點各基因型與年齡進行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP可靠性檢測4種SNP聚類圖中2個純合子分型根據(jù)產(chǎn)物峰高分別在靠近橫、縱軸聚類，在二者之間單獨聚類的一組為雜合子，均為正常聚類圖，表明檢測結(jié)果可靠(圖 1)。

圖1 SNP分型聚類圖

2.2 H-W平衡和MAF檢驗rs10759932位點有效樣本374份，檢出率98.42%；rs11536879位點有效樣本376份，檢出率98.95%；rs11536891位點有效樣本374份，檢出率98.42%；rs1927914位點有效樣本366份，檢出率96.32%。所有基因位點H-W平衡檢驗P值和MAF值均大于0.05。提示樣本來自一個穩(wěn)定的群體，具有群體代表性。詳見表 2。

表2 H-W平衡和MAF檢驗結(jié)果

2.3 病例組與對照組中SNP位點各基因型分布比較TLR4 rs10759932 T/C基因型頻率分布(χ2=3.692，P=0.158)、rs11536879 A/G基因型頻率分布(χ2=0.615，P=0.735)和rs11536891 T/C基因型頻率分布(χ2=1.975，P=0.373)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。rs1927914 A/G基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.267P=0.010)，對照組GG頻率顯著高于病例組(表3)。

二分類logistic回歸分析顯示，rs1927914 GG基因型發(fā)生腦梗死風(fēng)險的概率是AA型的37.7%(校正OR=0.377，95%CI為0.189～0.750，P=0.005)；其余SNP位點基因型統(tǒng)計學(xué)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

2.4 病例組SNP位點各基因型與發(fā)病年齡的相關(guān)性rs11536891基因型與發(fā)病年齡存在負(fù)相關(guān)(r=-0.156，P=0.035)，表明TC/CC基因型容易出現(xiàn)早發(fā)缺血性腦卒中。其余SNP位點基因型與發(fā)病年齡均無相關(guān)性(表5)。

表3 病例組與對照組SNP位點各基因型分布比較(n)

表4 SNP位點各基因型二分類Logistic分析結(jié)果

表5 病例組SNP位點各基因型與發(fā)病年齡的相關(guān)性結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中的基因多態(tài)性的研究很大程度上受限于樣本的例數(shù)大小和其遺傳異質(zhì)性。在目前已研究的相關(guān)基因多態(tài)性中，其遺傳多態(tài)性亦存在明顯的種族差異性，盡管基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究成果不盡一致，其分子遺傳學(xué)研究對腦梗死的基因治療以及腦梗死疾病易感人群的檢測和早期防治提供依據(jù)[10]。缺血性腦卒中發(fā)生時，炎性反應(yīng)在腦損傷的形成機制中起重要作用，既往已明確Toll樣受體可以參與多種炎性細(xì)胞及分子的識別，是誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因素；其中，TLR4廣泛分布于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元中，參與腦卒中后炎性腦損傷的病理過程。腦損傷后壞死細(xì)胞中釋放的熱休克蛋白等能激發(fā)TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，而進一步損傷的神經(jīng)元產(chǎn)生的熱休克蛋白60等能激活更多的TLR4及神經(jīng)毒性受體形成惡性循環(huán)[11]。腦缺血時，TLR4顯著升高，與相應(yīng)配體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進細(xì)胞因子的合成和釋放，通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途徑介導(dǎo)炎性反應(yīng)及凋亡[12]。

已有研究探討了中國北方漢族人群基因多態(tài)性與缺血性腦卒中TOAST亞型的關(guān)系：rs1927911位點TT基因型頻率在LAA組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.652，95%CI=0.436～0.974，P=0.037)。rs2149356位點A等位基因頻率在LAA組明顯高于對照組(OR=1.413，95%CI=1.125～1.790，P=0.004)；rs1927914位點基因型頻率及等位基因頻率在LAA組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義[13]。然而，Gu等[14]的研究則發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)男性缺血性腦卒中患者的rs1927914基因多態(tài)性有統(tǒng)計學(xué)差異，其相關(guān)性如下：加性模型(additive model，AA + GGvs. AG)中患者OR(95%CI)為0.81(0.67～0.99)，P=0.039；等位基因模型(allele model，Avs. G)中患者OR(95%CI)為0.81(0.66～0.99)，P=0.037。這表明中國南、北方的漢族人群在缺血性腦卒中的發(fā)生機制上存在差異，也表明該病的發(fā)生是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果。本研究 也顯示，rs1927914 A/G基因型頻率分布在病例組和對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.267，P=0.010)，病例組GG頻率顯著低于對照組。rs1927914 GG基因型發(fā)生腦卒中風(fēng)險的概率是AA型的37.7%(校正OR=0.377，95%CI=0.189～0.750，P=0.005)。這與Gu等的研究報道一致。同時，本研究中首先對研究人群進行了H-W平衡和MAF檢驗，以確保所納入的群體具備代表性。而且，為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，剔除了會嚴(yán)重干擾結(jié)果的病例。本研究還對所有檢測樣本進行了聚類圖繪制，所有SNP位點的聚類圖均顯示出了良好的可靠性。

腦卒中疾病發(fā)生與年齡有顯著相關(guān)性，年齡越大，發(fā)病風(fēng)險越高[15]。高齡腦卒中患者可能只是衰老的表現(xiàn)，與基因因素相關(guān)性小，80歲以上的高齡腦卒中患者和40多歲的腦卒中患者發(fā)病機制可能不完全相同，年輕患者發(fā)生缺血性中風(fēng)對社會和家庭帶來的危害更大，可能長期致殘，生活質(zhì)量下降。本研究顯示病例組rs11536891基因型與發(fā)病年齡存在負(fù)相關(guān)，即TC/CC基因型容易出現(xiàn)早發(fā)缺血性腦卒中。當(dāng)然，本研究也存在很多不足，如病例數(shù)量不夠大，可能影響實驗結(jié)果；在檢測過程中，某些樣品檢測失敗，造成檢出率無法達到100%，可能存在數(shù)據(jù)偏倚。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，rs1927914基因位點基因型與缺血性腦卒中的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)，G為該基因位點的保護基因；rs11536891基因型與缺血性腦卒中的發(fā)病年齡存在負(fù)相關(guān)，TC/CC基因型更容易出現(xiàn)早發(fā)缺血性腦卒中。目前流行病學(xué)和動物模型研究均表明腦梗死是遺傳性疾病，但基因和環(huán)境的共同作用對腦卒中發(fā)病影響仍待研究。此外，與腦卒中相關(guān)的基因與發(fā)病年齡的相關(guān)性仍需要深入探討，以便延緩腦卒中發(fā)病或及時救治。