蘇顯都 林明利 符步遠 范長玲

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是一類以神經(jīng)功能缺損癥狀為主要臨床表現(xiàn)的常見腦血管疾病，其發(fā)病率、致殘率及死亡率均較高，是嚴重危害人類生命健康的主要公共衛(wèi)生問題之一[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)作為一類新型的基因調(diào)控分子，通過調(diào)節(jié)基因表達參與腦卒中的發(fā)生發(fā)展，有望作為AIS診斷及預(yù)后的潛在生物學標志物[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在AIS中存在異常表達，參與調(diào)控AIS的一系列復雜的病理生理過程，為AIS的治療提供了新的靶點[3]。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是反映動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展程度的實驗室指標，在AIS的組織損傷和炎性反應(yīng)過程中起到重要的作用[4]。本研究通過檢測AIS患者血清miR-17-5p及Hcy水平，分析miR-17-5p聯(lián)合Hcy預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的價值，旨在為AIS的早期救治提供參考依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象收集2016-01-01至2019-03-31儋州市人民醫(yī)院收治的AIS患者158例，其中男102例、女56例，年齡37～84歲，平均(52.60±8.24)歲。納入標準：(1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南(2018年)》[5]診斷標準；(2)在發(fā)病24 h內(nèi)入院，且經(jīng)頭顱CT或MRI檢查顯示缺血性病灶。排除標準：(1)出血性卒中、腦外傷、高血壓腦病、腦炎及其他腦血管疾病者；(2)存在嚴重心肺疾病、肝腎功能不全、嚴重感染、多發(fā)性硬化、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病者。另選擇同期作者醫(yī)院健康體檢正常者60名作為對照組，其中男38名、女22名，年齡36～82歲，平均(51.30±7.85)歲。本研究經(jīng)作者醫(yī)院倫理委員會批準，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；總RNA快速提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑(北京天根生化科技有限公司)；日立7600全自動生化分析儀(日本日立公司)；ST16R高速冷凍離心機(美國熱電公司)。

1.3 方法本研究采用前瞻性研究方法。記錄所有患者確診入院時的一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)疾病、心率、血壓及血脂等。采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評分評估患者確診入院時的神經(jīng)功能缺損程度，其中<5分為輕度神經(jīng)功能缺損47例(輕度組)，5～20分為中度神經(jīng)功能缺損度73例(中度組)，>20分為重度神經(jīng)功能缺損38例(重度組)。于患者發(fā)病后3個月使用根據(jù)改良Rankin量表(modified Rankin Scale，mRS)評價預(yù)后情況，mRS評分≤2為預(yù)后良好組98例，mRS評分>2為預(yù)后不良組60例。

所有患者均于發(fā)病入院當天抽取靜脈血5 mL置于未加抗凝劑的離心管中，于室溫以2500 r/min、離心半徑 8 cm離心15 min，吸取上層血清400 μL，加入1 mL提取劑(Trizol)，于-70℃保存。按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。以U6(一種細胞內(nèi)有小核RNA，參與miRNA前體的加工過程，經(jīng)常用作miRNA的內(nèi)參)為內(nèi)參，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系15 μL：包括RNA模板5 μL，U6及miRNA特異性莖環(huán)引物3 μL，100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs) 0.15 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)1.00 μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.50 μL，RNase抑制劑(20 U/μL)0.19 μL，無菌三蒸水4.16 μL。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min、42℃ 30 min、85℃ 5 min。擴增反應(yīng)體系20 μL：包括引物及探針Mix(20×)1 μL，TaqMan通用混合物溶液(2×)10 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1.33 μL，無核酸酶的水7.67 μL。擴增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s、60℃退火60 s循環(huán)45次。每個反應(yīng)體系中熒光信號達到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-△△Ct法計算miR-17-5p的相對表達水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。采用日立7600全自動生化分析儀及配套試劑檢測Hcy水平。

比較各組間血清miR-17-5p及Hcy水平差異；繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)分析miR-17-5p聯(lián)合Hcy預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的價值。分析AIS患者預(yù)后不良組和預(yù)后良好組血清miR-17-5p、Hcy水平與NIHSS及mRS評分的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；兩獨立樣本均數(shù)的比較采用成組t檢驗。計數(shù)資料以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制ROC曲線分析miR-17-5p聯(lián)合Hcy預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的價值，曲線下面積(area under cure，AUC)比較采用Z檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AIS患者預(yù)后不良組和預(yù)后良好組臨床資料比較預(yù)后不良組年齡、有糖尿病史患者比例、NIHSS及mRS評分明顯高于預(yù)后良好組(P<0.01)；兩組間性別，體質(zhì)指數(shù)，有心房顫動、高血壓史、冠心病史、高脂血癥史、吸煙史及飲酒史者比例，心率、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具體見表1。

表1 AIS患者預(yù)后不良組和預(yù)后良好組臨床一般資料比較

2.2 AIS組和對照組血清miR-17-5p及Hcy水平比較AIS組血清miR-17-5p及Hcy水平明顯高于對照組(P<0.01)。具體見表2。

表2 AIS組和對照組血清miR-17-5p及Hcy水平比較

2.3 AIS患者預(yù)后不良組和預(yù)后良好組血清miR-17-5p及Hcy水平比較預(yù)后不良組血清miR-17-5p及Hcy水平明顯高于預(yù)后良好組(P<0.01)。具體見表3。

表3 AIS患者預(yù)后不良組和預(yù)后良好組血清miR-17-5p及Hcy水平比較

2.4 不同程度神經(jīng)功能缺損AIS患者血清miR-17-5p及Hcy水平比較重度組血清miR-17-5p及Hcy水平均明顯高于中度組和輕度組(均P<0.01)，且中度組血清miR-17-5p及Hcy水平亦均明顯高于輕度組(均P<0.01)。具體見表4。

表4 不同神經(jīng)功能缺損AIS患者血清miR-17-5p及Hcy水平比較

圖1 血清miR-17-5p及Hcy水平預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的ROC曲線

2.5 血清miR-17-5p及Hcy水平預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的價值血清miR-17-5p及Hcy水平預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的最佳截值分別為2.06、17.62 μmol/L，其敏感度和特異度為92.0%和85.3%。miR-17-5p聯(lián)合Hcy預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的AUC(95%CI)為0.918(0.860～0.975)，明顯高于單用miR-17-5p〔0.837(0.780～0.894)；Z=4.726，P<0.05〕及Hcy〔0.796(0.738～0.857)；Z=5.328，P<0.05〕預(yù)測所得AUC(95%CI)。具體見圖1。

2.6 血清miR-17-5p、Hcy水平與NIHSS及mRS評分的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，預(yù)后不良組血清miR-17-5p水平與NIHSS及mRS評分均呈正相關(guān)(分別r=0.772、0.853，P<0.01)，血清Hcy水平與NIHSS及mRS評分亦均呈正相關(guān)(分別r=0.740、0.807，P<0.01)。預(yù)后良好組血清miR-17-5p及Hcy水平與NIHSS(分別r=0.162、0.205，P<0.01)及mRS評分(分別r=0.131、0.174，P<0.01)均無明顯相關(guān)。

3 討論

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，通過影響靶基因的表達，參與AIS的一系列復雜的病理生理過程啟動，并促進了AIS的進程[6]。Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AIS中差異表達的miRNA可能參與炎性介質(zhì)的釋放及內(nèi)皮細胞功能紊亂，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成及破裂，影響腦卒中的發(fā)生。亦有研究認為，miRNA參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂，并且在神經(jīng)元破壞、修復及病灶局部炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，為AIS的治療提供了新的靶點[8]。Hcy是一種含硫氨基酸，主要由甲硫氨基酸經(jīng)脫甲基代謝后產(chǎn)生，其水平增高可使一氧化氮等血管舒張因子滅活，并且直接或間接地使血管內(nèi)皮細胞功能受到損害，引起血液中的脂質(zhì)沉積于血管壁，從而促進動脈硬化的發(fā)生及血栓的形成。Larsson等[9]研究表明，Hcy是一種導致血管損傷的氨基酸，可能參與腦卒中發(fā)生及發(fā)展過程，在急性腦血管病的診斷及預(yù)后判斷中具有重要作用。

本研究顯示，AIS組血清miR-17-5p及Hcy水平明顯高于健康對照組，提示miR-17-5p及Hcy高表達可能參與AIS的發(fā)生發(fā)展。本研究中AIS患者預(yù)后不良組血清miR-17-5p及Hcy水平明顯高于預(yù)后良好組，而且不同程度神經(jīng)功能缺損患者血清miR-17-5p及Hcy水平存在差異，神經(jīng)功能缺損越嚴重，miR-17-5p及Hcy水平升高越明顯。上述結(jié)果提示血清miR-17-5p及Hcy水平升高與AIS預(yù)后不良密切相關(guān)，且能夠反映AIS患者神經(jīng)功能缺損的嚴重程度。

Gacoń等[10]研究表明，miRNA是基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，與AIS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對臨床預(yù)測、診斷及治療AIS具有重要意義。Wu等[11]的研究認為，miRNA表達水平與腦卒中患者神經(jīng)功能缺損嚴重程度有關(guān)，可作為評估AIS神經(jīng)缺陷嚴重性的生物學指標。Harris等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血清高Hcy是引起腦血管事件發(fā)生的獨立危險因素，與腦卒中患者病情發(fā)生及進展有關(guān)，可作為腦卒中病情嚴重程度評估的重要指標。本研究進一步應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示血清miR-17-5p及Hcy水平預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的最佳截值分別為2.06、17.62 μmol/L，敏感度和特異度相對較高，且miR-17-5p與Hcy聯(lián)合預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的曲線下面積明顯大于兩者分別單用時，提示兩者聯(lián)用有助于提高預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的準確性。

盧彪等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清Hcy水平在AIS患者中明顯升高，且與患者神經(jīng)功能缺損嚴重程度相關(guān)，可作為患者病情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的評價指標。另有研究表明，血清miR-17-5p表達水平在AIS患者中明顯升高，是判斷AIS存在的一個獨立的預(yù)測指標，也是一個很有前途的AIS診斷和預(yù)后的生物標志物[14]。NIHSS評分是目前國際上最常用的腦卒中評估量表，不僅可用于評估腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損程度，還可定期評估腦卒中患者的治療效果。mRS評分是用來評估腦卒中后患者在日?；顒又械臍埣渤潭然颡毩⒛芰?，其得分越高，說明殘疾程度越嚴重，預(yù)后較差。本研究中預(yù)后不良組NIHSS及mRS評分明顯高于預(yù)后良好組，相關(guān)分析顯示，預(yù)后不良組血清miR-17-5p及Hcy水平與NIHSS評分及mRS評分均呈正相關(guān)，這進一步表明血清miR-17-5p及Hcy水平升高與AIS患者神經(jīng)功能缺損的嚴重程度及預(yù)后不良密切相關(guān)，有可能作為預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的潛在標志物。

綜上所述，血清miR-17-5p及Hcy水平升高與AIS患者神經(jīng)功能缺損的嚴重程度及預(yù)后不良相關(guān)，miR-17-5p聯(lián)合Hcy預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的價值較高，有望作為預(yù)測AIS患者預(yù)后不良的生物標志物，并可能為AIS的臨床治療提供新的思路。