劉德山 陳佃福 張旭

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一種常見的、與老化密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,其發(fā)病率卻逐年升高［1］,AD 預(yù)期的發(fā)病率將達到2001年的300%［2］。迄今已發(fā)現(xiàn)多個AD 的致病基因,如APP 基因、早老素基因1(PS1)和早老素基因 2(PS2)等,國際上多個研究團隊通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)發(fā)現(xiàn)了一系列散發(fā)性AD 的易感基因［3,4］,前期研究提示CD2AP 表達水平下降可能參與AD 的發(fā)?。?］。目前國內(nèi)外對CD2AP 在腎臟疾病中的致病機制研究較多,發(fā)現(xiàn)其參與多個信號通路并在維持細胞骨架中起著重要作用［6］。近期有國內(nèi)外研究［7］以及本團隊前期的研究均提示CD2AP 參與AD的病理過程,但其在AD 發(fā)病中的具體機制仍不清楚。

突觸相關(guān)的結(jié)構(gòu)組成主要包括Actin 細胞骨架、突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic dentisy,PSD)、谷氨酸受體等神經(jīng)遞質(zhì)受體和一些信號蛋白分子等。在研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用全反式維甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)干預(yù)N2A 細胞后,發(fā)現(xiàn)CD2AP 的表達明顯升高,N2A 細胞神經(jīng)突起明顯變長,轉(zhuǎn)染過表達CD2AP 后,神經(jīng)突起顯著變長,而轉(zhuǎn)染shRNA 下調(diào)CD2AP 的表達水平后,神經(jīng)突起顯著變短,提示CD2AP 在神經(jīng)元骨架的形成中起著重要作用,提示CD2AP 可能在神經(jīng)元突觸可塑性中起著重要作用。有研究報道神經(jīng)元受損后在神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用下,CD2AP 可參與影響神經(jīng)元骨架蛋白Actin 及受體的內(nèi)吞作用。CD2AP 作為信號通路與細胞骨架重要的聯(lián)系分子,可與微絲骨架結(jié)合蛋白相互作用,在谷氨酸的誘導(dǎo)下,參與突觸形成、遷移等過程,本研究將通過體外ATRA 誘導(dǎo)N2A 細胞神經(jīng)突起的生長,探討CD2AP 如何調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的生長,為后續(xù)深入研究CD2AP 如何調(diào)控突觸可塑性提供重要理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 ①細胞系：SH-SY5Y 細胞：購自中國科學院上海細胞所；N2A 細胞：本實驗室保種。②病毒：shRNACD2AP：山東維真公司；overexpressionCD2AP：上海吉凱公司。

1.2 方法

1.2.1 ATRA 干預(yù)N2A 細胞 復(fù)蘇N2A 細胞應(yīng)用ATRA 干預(yù)(干預(yù)濃度為20 μmol/L,干預(yù)時間為5 d)后,密切觀察細胞狀態(tài),繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.2 病毒轉(zhuǎn)染 利用維真公司包裝的shRNACD2AP病毒和吉凱公司overexpressionCD2AP 病毒進行轉(zhuǎn)染；感染約72 h,觀察感染效率,進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞免疫熒光 細胞爬片經(jīng)處理后,放入12 孔板各孔中并于多聚賴氨酸進行包被。在轉(zhuǎn)染前1 d 鋪細胞(N2A),每孔鋪約1×105個細胞。第2 天轉(zhuǎn)染病毒或進行ATRA 干預(yù)、轉(zhuǎn)染或干預(yù)后進行細胞免疫熒光染色。

1.2.4 Western blot 從培養(yǎng)箱中取出細胞,抽提的總蛋白,采用Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度,電泳、轉(zhuǎn)膜后用封閉液稀釋抗體［兔抗CD2AP單克隆抗體(1∶1000)、鼠抗GAPDH(1∶1000)、鼠抗β-actin(1∶1000)］,孵育4℃過夜,用TBST 洗膜,再用封閉液稀釋相應(yīng)的二抗,室溫下孵育1 h,TBST 洗膜后,采用Millipore 公司ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯色,應(yīng)用Image Lab 軟件進行化學發(fā)光成像、分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS14.0 統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。Western blot 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,進行Levene 方差齊性檢驗,方差齊時,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；方差不齊時,采用Games-Howell 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

ATRA 誘導(dǎo)N2A 細胞后,CD2AP 的表達明顯升高,N2A 細胞神經(jīng)突起明顯變長；上調(diào)、下調(diào)N2A 細胞中的CD2AP 后,細胞突起顯著變長,ATRA 通過調(diào)控CD2AP 表達影響神經(jīng)突起生長。

CD2AP 參與生長因子信號的蛋白復(fù)合物的支架,CD2AP mRNA 和蛋白在大腦中均有表達,Allen 腦圖譜表明CD2AP mRNA存在于特定區(qū)域的成年大鼠大腦中,特別是具有可塑性高的區(qū)域,為了確定CD2AP 是否參與對神經(jīng)突觸生長的調(diào)節(jié),在應(yīng)用ATRA 進行干預(yù)(干預(yù)濃度為20 μmol/L,干預(yù)時間為5 d)的N2A 細胞中檢測了CD2AP 的表達情況。免疫熒光結(jié)果表明,N2A 細胞應(yīng)用ATRA 干預(yù)后,其神經(jīng)突起長度明顯變長。見圖1。同時,Western blot 法檢測結(jié)果表明ATRA 干預(yù)后,CD2AP 蛋白表達水平呈顯著升高。結(jié)果表明CD2AP蛋白水平受到ATRA 的正調(diào)控,并在N2A 細胞神經(jīng)突起生長過程中起著重要作用。

為進一步研究CD2AP 對神經(jīng)突起生長的調(diào)控,應(yīng)用shRNACD2AP 和overexpressionCD2AP 兩種病毒分別對N2A 細胞進行上調(diào)和下調(diào)CD2AP 蛋白水平的干預(yù)。72 h 后,overexpressionCD2AP 轉(zhuǎn)染W(wǎng)estern blot 檢測發(fā)現(xiàn)CD2AP 的表達量呈顯著升高,細胞神經(jīng)突起長度明顯變長。見圖2。相反的,轉(zhuǎn)染shRNACD2AP 介導(dǎo)的CD2AP 表達減少導(dǎo)致了與蛋白質(zhì)的減少程度一致的神經(jīng)突起的長度顯著降低。見圖3。結(jié)果顯示,CD2AP 蛋白可能參與了神經(jīng)突起生長的調(diào)控。

圖1 在N2A 細胞分化突起生長過程中CD2AP 表達水平顯著升高

圖2 overexpressionCD2AP 干預(yù)N2A 細胞后CD2AP 表達水平顯著升高、神經(jīng)突起顯著變長

圖3 shRNACD2AP 干預(yù)N2A 細胞后,N2A 細胞CD2AP 表達下調(diào)、神經(jīng)突起變短

3 討論

AD 其主要臨床表現(xiàn)為慢性、進行性認知功能損害,其起病隱襲,初始癥狀表現(xiàn)為記憶力缺失,癥狀會隨著病情進展逐漸加重,認知和記憶功能不斷惡化,AD 患者認知功能下降主要與突觸功能的異常相關(guān),且突觸功能紊亂常常早于突觸的丟失。突觸前和突觸后相關(guān)蛋白均出現(xiàn)不同程度的下降,而且與認知功能的下降明顯相關(guān),可見突觸功能的正常運轉(zhuǎn)以及維持與突觸相關(guān)蛋白的正常表達密不可分。突觸相關(guān)蛋白是突觸可塑性重要的分子基礎(chǔ)。有研究報道包括突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化是AD 患者和AD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦部最早出現(xiàn)的表型,并且突觸水平的變化和認知功能損害的程度密切相關(guān)。而與突觸相關(guān)的結(jié)構(gòu)組成主要包括Actin 細胞骨架、突觸后致密物質(zhì)、谷氨酸受體［主要包括N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)］等神經(jīng)遞質(zhì)受體和一些信號蛋白分子等。影響上述分子和信號通路的因素均可能影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能,進而可影響突觸可塑性。

在本研究中,應(yīng)用ATRA 干預(yù)N2A 細胞后,發(fā)現(xiàn)CD2AP 的表達明顯升高,N2A 細胞神經(jīng)突起明顯變長,轉(zhuǎn)染overexpressionCD2AP 病毒后,CD2AP 過表達,神經(jīng)突起顯著變長,而轉(zhuǎn)染shRNA 下調(diào)CD2AP 的表達水平后,神經(jīng)突起顯著變短,提示CD2AP 在神經(jīng)元骨架的形成中起著重要作用。這和既往在腎病研究中報道的CD2AP 對調(diào)節(jié)足細胞的骨架結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用的結(jié)果相一致［5］,提示CD2AP 可能在神經(jīng)元突觸可塑性中起著重要作用。

總之,ATRA 干預(yù)N2A 細胞后可上調(diào)CD2AP 的表達,或者overexpressionCD2AP 轉(zhuǎn)染細胞上調(diào)CD2AP的表達后,都可促進N2A 細胞神經(jīng)突起的生長,而shRNACD2AP 下調(diào)CD2AP 的表達后,神經(jīng)突起顯著變短,進而說明CD2AP 在神經(jīng)突觸生長過程中起著重要的作用,目前有大量的研究表明AD 患者認知功能下降,其主要原因是突觸功能障礙［6,7］。這些結(jié)果對理解CD2AP 基因增加AD 易感性的特點提供了重要信息,從而為深入研究CD2AP 增加AD 易感性的發(fā)生機制獲得一點啟示,同時也為今后的研究提供了依據(jù),在后續(xù)的研究中進一步深入探討CD2AP 調(diào)控突觸可塑性的信號通路。