梅余琪,魏麗芳,鄒立思,劉訓(xùn)紅,陳佳麗,談夢霞,王程成,蔡芷辰,殷圣鑫,張芙蓉

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

雞血藤(Spatholobi Caulis)為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖,收載于2015年版《中國藥典》,具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)之功效,主要用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、風(fēng)濕痹痛、麻木癱瘓和血虛萎黃等癥[1]。雞血藤是一味較為常用的傳統(tǒng)中藥,藥用價值高,市場需求量大,為多種中成藥的原料藥?，F(xiàn)代研究表明,雞血藤主要含有黃酮類、萜類、甾醇類、蒽醌類、有機(jī)酸類等化學(xué)成分[2-4]。其中黃酮類成分具有抗腫瘤[5-7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗貧血[10]等多種藥理活性；酚酸類成分原兒茶酸具有抗菌、抗炎作用,對心血管系統(tǒng)有明顯的藥理活性[11]?！氨鏍钫撡|(zhì)”是根據(jù)藥材外觀性狀特征判斷其質(zhì)量的優(yōu)劣,是中藥材經(jīng)驗鑒別的精髓,其實(shí)質(zhì)是中藥材的性狀特征與內(nèi)在質(zhì)量具有相關(guān)性。雞血藤藥材斷面含深棕色樹脂狀物的韌皮部與木質(zhì)部相間排列,呈數(shù)個偏心性半圓形環(huán)或同心性橢圓形環(huán)[12],傳統(tǒng)經(jīng)驗對雞血藤藥材的質(zhì)量評價認(rèn)為韌皮部環(huán)數(shù)需3～8環(huán),但這種“辨狀論質(zhì)”的科學(xué)內(nèi)涵至今仍不清楚,尚需深入探討雞血藤的韌皮部環(huán)數(shù)與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性。

關(guān)于雞血藤藥材的質(zhì)量評價研究,目前多以單一成分或單黃酮類成分為考察指標(biāo),如兒茶素、表兒茶素等黃烷醇類成分[13-15],而關(guān)于同時測定多指標(biāo)成分的研究很少，且多采用高效液相色譜法(HPLC)[16-17]。超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)具有多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)定量分析功能,融合了高靈敏度、高精度和高通量的優(yōu)點(diǎn),更適合中藥多組分復(fù)雜體系的分離與分析[18-20]。

中藥的藥效是多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果,因此本實(shí)驗通過UFLC-QTRAP-MS/MS同時測定雞血藤中黃烷醇、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、查耳酮、紫檀烷、花色素及酚酸類共22種指標(biāo)成分,對不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤共3個產(chǎn)區(qū)88個批次藥材進(jìn)行分析,探究雞血藤韌皮部環(huán)數(shù)與指標(biāo)成分含量的相關(guān)性,并結(jié)合主成分分析(PCA)對所有批次不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤藥材進(jìn)行綜合評價。旨在為建立雞血藤藥材多指標(biāo)成分的綜合評價體系奠定基礎(chǔ),為根據(jù)性狀特征評價雞血藤的藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù),亦為闡明中藥傳統(tǒng)經(jīng)驗精髓“辨狀論質(zhì)”的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

SIL-20A XR超快速液相色譜儀、LC-20AD二元輸液泵、STL-20A XR自動進(jìn)樣器和CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司)；AB QTRAP 5500三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀、電噴霧離子源及Analyst 1.6.3軟件(美國AB SCIEX 公司)；Q-500B高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司)；ME36S型電子分析天平(百萬分之一,德國賽多利斯公司)；BSA224S型電子分析天平(萬分之一,德國賽多利斯公司)；KQ-500B超聲波清洗機(jī)(超聲功率500 W,40 kHz,昆山超聲儀器有限公司)；湘儀H1650-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)。

對照品(純度均大于98%)：櫻黃素(批號lw18020202)、大豆苷(批號lw18081701)、美迪紫檀素(批號lw181025091)、染料木素(批號lw18051601)、原花青素B2(批號lw18042608)、柚皮素(批號lw18032311)、二氫槲皮素(花旗松素，批號lw18030202)、雞蛋黃素(鷹嘴豆芽素A，批號lw18010502)、染料木苷(批號lw18082201)、甘草素(批號lw18032403)、毛蕊異黃酮(批號lw18022412),購自南京良緯生物科技有限公司；表兒茶素(批號110878-200102)、蘆丁(批號100080-200707)、山柰酚(批號110861-201310)、芒柄花素(批號111703-200602),購自中國藥品生物制品檢定所；芒柄花苷(批號CHB1-71026)、沒食子兒茶素(批號CHB151105)、表沒食子兒茶素(批號CHB160513)、異甘草素(批號CHB171011),購自成都克洛瑪生物科技有限公司；大豆苷元(批號C06N6Y5504)、原兒茶酸(批號B21614),購自上海源葉生物科技有限公司；兒茶素(批號20161221),購自寶雞市辰光生物科技有限公司。甲醇、乙腈與甲酸(色譜純,德國默克公司)；甲醇(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司)；三氯甲烷(色譜純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗用水為Milli-Q超純水。

雞血藤藥材樣品于2018年11月分別采自廣東高要、越南奠邊府、老撾瑯勃拉邦同一植株上不同韌皮部環(huán)數(shù)(3～10環(huán))的藤莖,趁鮮切片并曬干,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定均為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的藤莖,表1為雞血藤樣品信息。憑證藥材于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定實(shí)驗室留樣。

表1 88批雞血藤的樣品信息Table 1 Sample informations of 88 batches of Spatholobi Caulis

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液分別精密稱取一定量的沒食子兒茶素、原兒茶酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、大豆苷、二氫槲皮素、染料木苷、蘆丁、芒柄花苷、甘草素、大豆苷元、毛蕊異黃酮、柚皮素、染料木素、山柰酚、異甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素、櫻黃素、雞蛋黃素對照品,置于5 mL容量瓶中,加甲醇溶解分別配制成0.970、1.042、0.994、0.996、1.035、1.004、1.110、0.980、1.032、0.990、0.988、1.052、1.006、1.010、1.038、1.002、1.006、1.300、1.026、1.135、0.456、1.184 mg·mL-1的對照品儲備液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,備用。分別取適量的各對照品儲備液,加甲醇定容至5 mL配制成混合對照溶液,并逐級稀釋,得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照工作溶液,使用前保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 供試品溶液將樣品粉末過50目篩后精密稱定1.0 g,置于25 mL具塞錐形瓶中,加入10 mL三氯甲烷-甲醇(4>∶1,體積比)溶液,密閉,稱重,室溫下超聲(功率500 W,頻率40 kHz)60 min,放置冷卻,再次稱重,用三氯甲烷-甲醇(4>∶1)溶液補(bǔ)足失重,過濾,將濾液離心10 min(12 000 r/min)。取上清液,過0.22 μm微孔濾膜后稀釋10倍,備用。

1.3 實(shí)驗條件

1.3.1 色譜條件色譜柱XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：0.3%甲酸水(A)-甲醇(B)；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：2.0 μL。洗脫梯度：0～5 min,15%～30%B；5～10 min,30%～40%B；10～13 min,40%～45%B；13～15 min,45%B；15～18 min,45%～55%B；18～23 min,55%～65%B；23～28 min,65%～100%B；28～30 min,100%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子掃描模式檢測；離子化溫度(TEM)：550 ℃；霧化氣(GS1)流速：55 L·min-1；輔助氣(GS2)流速：55 L·min-1；氣簾氣(CUR)流速：40 L·min-1；噴霧電壓(IS)：正離子模式下4 500 V,負(fù)離子模式下-4 500 V；接口加熱,全程通入氮?dú)狻?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化考察了Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18柱(150 mm×2.1 mm,2.2 μm)、XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)、SynergiTMHydro-RP 100 ?柱(2.0 mm×100 mm,2.5 μm)3種色譜柱的分離效果,結(jié)果顯示,XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)具有更好的分離效果和檢測靈敏度,故實(shí)驗選擇XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)作為色譜柱。進(jìn)一步考察了以乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇與0.3%甲酸水-甲醇為流動相時的分離效果。結(jié)果表明,流動相采用0.3%甲酸水-甲醇時,各色譜峰峰形及分離較好。因此實(shí)驗選擇以0.3%甲酸水-甲醇為流動相。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化考察了22種待測成分在電噴霧離子源正、負(fù)離子模式下的響應(yīng),結(jié)果表明,原兒茶酸、染料木苷和山柰酚在負(fù)離子模式下有較強(qiáng)的響應(yīng)和更好的峰形,而其他成分與之相反,因此原兒茶酸、染料木苷和山柰酚選擇負(fù)離子模式,其他成分采用正離子模式進(jìn)行檢測。各成分的保留時間和質(zhì)譜條件見表2,混合對照溶液的MRM圖見圖1。

表2 22種目標(biāo)物的保留時間及優(yōu)化的質(zhì)譜條件Table 2 Retention times and optimized MS parameters of 22 analytes

圖1 22種目標(biāo)成分混合對照溶液(10 μg/mL)的MRM圖Fig.1 MRM chromatograms of 22 constituents in mixed reference solution(10 μg/mL)the peak numbers denoted were the same as those in Table 2

2.2 供試品制備方法的優(yōu)化

實(shí)驗以兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素及芒柄花素色譜峰的峰面積和峰形作為指標(biāo),對提取溶劑(30%甲醇/乙醇、50%甲醇/乙醇、70%甲醇/乙醇、90%甲醇/乙醇、三氯甲烷-甲醇(4>∶1))、藥液比(1>∶10、1>∶20、1>∶30、1>∶40)和提取時間(30、60、90 min)進(jìn)行單因素考察,結(jié)果表明以三氯甲烷-甲醇(4>∶1)作為提取溶劑、藥液比為1>∶10、提取時間為60 min時,上述5種成分的色譜峰峰面積較大且峰形較好。綜上,最優(yōu)制備方法為：三氯甲烷-甲醇(4>∶1)為提取溶劑,藥液比為1>∶10,提取時間為60 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限精密吸取“1.2.1”中不同質(zhì)量濃度的混合對照工作溶液,按“1.3”色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,通過繪制對照品的峰面積(Y)與相應(yīng)質(zhì)量濃度(X,ng·mL-1)的關(guān)系曲線,得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果顯示，各化合物在對應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r≥0.999 0)。在相同的色譜條件下,分別以約3倍和10倍信噪比確定各成分的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示22種成分的LOD為0.07～7.99 ng·mL-1,LOQ為0.22～26.63 ng·mL-1(見表3)。

2.3.2 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性精密吸取一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液2 μL,按本方法在1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次,分別計算各成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),作為日內(nèi)精密度；取上述混合對照品溶液連續(xù)3 d每天重復(fù)進(jìn)樣3次,分別計算各成分峰面積的RSD,作為日間精密度。結(jié)果表明,22種目標(biāo)成分的日內(nèi)RSD為0.60%～4.8%,日間RSD為0.90%～4.5%,說明儀器精密度良好(見表3)。

分別稱取同一雞血藤樣品粉末6份,按“1.2.2”方法制備供試品溶液,分別吸取2 μL進(jìn)樣分析,計算得22種目標(biāo)成分含量的RSD為0.70%～4.5%,表明該方法重復(fù)性良好；在不同時間間隔(0、2、4、8、12、24 h)對同一樣品進(jìn)行分析,測得22種目標(biāo)成分峰面積的RSD為0.50%～4.3%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗精密稱定9份已知含量的樣品,每份約0.5 g,置于具塞錐形瓶中,分別按已知含量的80%、100%、120%加入一定量的各對照品溶液(每個水平3份),按“1.2.2”制備加標(biāo)回收供試品溶液,并按上述色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定后,計算各成分的平均回收率及RSD。22種目標(biāo)成分的平均回收率為96.8%～103%,RSD為0.80%～4.4%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好(見表3)。

表3 22種目標(biāo)成分的線性范圍、檢出限、定量下限、精密度及加標(biāo)回收率實(shí)驗結(jié)果Table 3 Linear ranges,limits of detection,limits of quantitation,precisions and recovery experimental results of 22 compounds

(續(xù)表3)

圖2 高要、越南、老撾產(chǎn)區(qū)不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤中22種目標(biāo)成分總含量的柱狀圖Fig.2 Histogram of 22 target components in Spatholobi Caulis with different phloem ring numbers from Gaoyao,Vietnam and Laos

2.4 樣品含量測定

吸取2 μL供試品溶液注入液相色譜-質(zhì)譜儀,按上述條件測定,根據(jù)線性方程分別計算供試品溶液中待測目標(biāo)成分的含量。對高要、越南、老撾3個產(chǎn)區(qū)雞血藤中所測成分總含量進(jìn)行柱狀圖分析(如圖2),結(jié)果表明不同產(chǎn)地之間雞血藤中各成分的總含量存在一定差異,其中高要產(chǎn)區(qū)的總含量整體高于越南和老撾兩產(chǎn)地。

3個產(chǎn)區(qū)不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤中的原兒茶酸含量和黃酮類成分總含量見圖3。由圖3可知,3個產(chǎn)地雞血藤各樣品中原兒茶酸的含量均高于黃酮類成分總含量,且原兒茶酸與兩類成分總含量的變化趨勢基本一致。高要、越南、老撾三產(chǎn)區(qū)分別以韌皮部環(huán)數(shù)10環(huán)、8環(huán)、9環(huán)的雞血藤中指標(biāo)成分含量較高。高要產(chǎn)區(qū)不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤,指標(biāo)成分總量幾乎隨韌皮部環(huán)數(shù)增加而上升；越南產(chǎn)區(qū)不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤,3～8環(huán)的指標(biāo)成分總量隨韌皮部環(huán)數(shù)增加而上升；而老撾產(chǎn)區(qū)不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤,指標(biāo)成分總量呈鋸齒形變化。整體而言,雞血藤韌皮部環(huán)數(shù)與多指標(biāo)成分含量具有一定的正相關(guān)性。

圖3 不同產(chǎn)區(qū)不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤中原兒茶酸含量和黃酮類成分總含量的動態(tài)變化圖Fig.3 Dynamic changes of protocatechuic acid and flavonoids in Spatholobi Caulis with different phloem ring numbers from different regionsA.Gaoyao，B.Vietnam，C.Laos;flavonoids,protocatechuic acid,flavonoids+protocatechuic acid

2.5 主成分分析

主成分分析根據(jù)多個變量之間的相關(guān)關(guān)系和某種線性組合進(jìn)行轉(zhuǎn)化,得到少數(shù)幾個保留較多信息且之間不相關(guān)的綜合變量,其目的是構(gòu)造輸入變量的少數(shù)線性組合,盡量多地解釋數(shù)據(jù)的變異性[21]。

本文采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件,將不同韌皮部環(huán)數(shù)的雞血藤藥材中22個成分的定量結(jié)果組成矩陣,數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析。主成分分析中特征值及貢獻(xiàn)率結(jié)果如下：第一主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為6.927和31.486%；第二主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為5.711和25.957%；第三主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為3.620和16.459%；第四主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為1.527和6.939%；第五主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為1.386和6.298%；其他主成分特征值的貢獻(xiàn)率依次減少。前5個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)87.139%,且特征值均大于1,能較客觀地反映不同韌皮部環(huán)數(shù)雞血藤藥材的綜合質(zhì)量,故選取前5個主成分進(jìn)行分析。

每個主成分均為原始變量的線性組合,線性組合中各變量對主成分的影響用載荷表示,載荷絕對值越大,表明其影響越大[22]。由表4可知,在第一主成分中,沒食子兒茶素、染料木苷和芒柄花苷的因子載荷量最大；第二主成分主要反映了甘草素和異甘草素的信息；在第三主成分中毛蕊異黃酮的載荷因子較大；第四主成分中蘆丁的載荷量較大,是對第四主成分影響較大的特征向量；第五主成分主要反映了櫻黃素和原兒茶酸的信息，此外，山柰酚和芒柄花素對第五主成分有較強(qiáng)的逆負(fù)荷。前5個主成分基本包含了大部分成分的信息。

表4 雞血藤藥材中各成分旋轉(zhuǎn)變換后的因子載荷矩陣Table 4 Rotated factor load matrix of each constituent in Spatholobi Caulis

不同雞血藤樣品的主成分各因子總得分見表5,可根據(jù)各主要因子的權(quán)重系數(shù)計算得出各樣品的綜合得分。權(quán)重系數(shù)由其方差貢獻(xiàn)的大小決定,各主成分的貢獻(xiàn)率與5個主成分的總貢獻(xiàn)率之比則為權(quán)重系數(shù),如第一主成分的權(quán)重系數(shù)應(yīng)為31.486%/87.139%=0.361 3,同理第二、三、四、五主成分的權(quán)重分別為0.297 9、0.188 9、0.079 6、0.072 3。各主成分因子得分與其權(quán)重系數(shù)乘積之和相加即為雞血藤樣品的總因子得分F,其表達(dá)式為F=0.361 3F1+0.297 9F2+0.188 9F3+0.079 6F4+0.072 3F5,其值越高,表明綜合質(zhì)量越好。由表5可知,高要產(chǎn)區(qū)10環(huán)、9環(huán)的雞血藤樣品綜合得分較高,藥材整體質(zhì)量優(yōu)于其3～8環(huán)的藥材；越南產(chǎn)區(qū)7～10環(huán)的雞血藤藥材質(zhì)量優(yōu)于3～6環(huán)的藥材；老撾產(chǎn)區(qū)4環(huán)、9環(huán)、10環(huán)的雞血藤藥材質(zhì)量優(yōu)于其它環(huán)數(shù)的藥材。相對而言,老撾產(chǎn)區(qū)的所有環(huán)數(shù)的雞血藤藥材綜合排名均較靠后,藥材質(zhì)量比高要和越南產(chǎn)區(qū)差。整體來看,以高要產(chǎn)區(qū)韌皮部環(huán)數(shù)10環(huán)、9環(huán)的雞血藤藥材綜合質(zhì)量較好。

表5 雞血藤藥材的主成分因子及品質(zhì)綜合評價Table 5 Principal component factors and comprehensive quality evaluation of Spatholobi Caulis

3 結(jié) 論

本文建立了同時測定雞血藤中多種指標(biāo)成分含量的UFLC-QTRAP-MS/MS方法,并結(jié)合PCA分析評價了不同韌皮部環(huán)數(shù)的雞血藤藥材質(zhì)量,考察了雞血藤韌皮部環(huán)數(shù)與指標(biāo)成分含量的相關(guān)性,從而為根據(jù)性狀特征評價雞血藤的藥材質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù),亦為闡明中藥傳統(tǒng)經(jīng)驗精髓“辨狀論質(zhì)”的科學(xué)內(nèi)涵提供了新的思路和方法。