胡 貝，李麗霞，劉 紅，楊飄飄，李曉健，黃 偉，丁曉萍

(1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省藥品質(zhì)量檢測(cè)與控制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

性激素是一種類固醇激素，包括雄激素、孕激素和雌激素[1]，其主體結(jié)構(gòu)為環(huán)戊烷并多氫菲核，不同化合物間的差別是環(huán)上碳原子所連的基團(tuán)不同[2-3]。它不僅具有控制性器官和第二性征的作用[4-5]，還參與人體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖分、無(wú)機(jī)鹽等生命基本物質(zhì)的代謝活動(dòng)[4]，是影響生殖健康的重要因素[6]。當(dāng)添加性激素的化妝品直接作用于皮膚上，短期內(nèi)可見(jiàn)促進(jìn)乳腺發(fā)育、增加毛發(fā)生長(zhǎng)等作用，但長(zhǎng)久使用會(huì)造成色素沉積、發(fā)育異常及人體代謝紊亂等副作用，甚至有致癌性[4,7]。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[8]和歐盟化妝品法規(guī)(Council Directive 76/768/EEC)[9]均將性激素列為禁用組分。

目前化妝品中性激素的分析方法有液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜-質(zhì)譜法[12-18]、聚合物整體柱微萃取-高效液相色譜法[19]、固相萃取-微乳液相色譜法[20]、凝膠滲透色譜-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21]、超高效合相色譜法[22]等。其中，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有分析時(shí)間短、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來(lái)化妝品中禁用組分分析的首選方法?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中 ，采用高效液相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定雌三醇等7種組分，其中高效液相色譜法雖前處理步驟簡(jiǎn)便，但無(wú)質(zhì)譜確證，可能造成假陽(yáng)性，而氣相色譜-質(zhì)譜法需衍生化，操作繁瑣、耗時(shí)；新增標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)化妝品中的63種激素類成分，其中僅包括13種性激素。林志惠等[12]、李晶瑞等[13]、鄭利等[17]利用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分別建立了同時(shí)測(cè)定化妝品中21種、15種和3種性激素的方法，陳少波等[14]運(yùn)用QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用建立了快速篩查化妝品中112種禁用藥物(含4種性激素)的方法，岳磊等[15]、茹歌等[16]運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分別建立了同時(shí)測(cè)定化妝品中5種和13種性激素的方法，劉齊等[18]運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用建立了同時(shí)測(cè)定育發(fā)液中9種禁限用物質(zhì)(含7種性激素)的方法。而我國(guó)實(shí)際生產(chǎn)并使用的性激素高達(dá)幾十種[4]，故現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法及文獻(xiàn)報(bào)道方法可同時(shí)檢測(cè)的性激素種類仍較少，可能存在不法商家為規(guī)避執(zhí)法添加法定檢測(cè)組分以外的性激素的違法行為。綜上所述，建立一種前處理方法簡(jiǎn)便省時(shí)、適應(yīng)性良好、涵蓋性激素種類多、定性定量準(zhǔn)確的檢測(cè)方法成為亟待解決的問(wèn)題。

本文以液體水基類、乳液類、膏霜類化妝品為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)提取溶劑、提取方式和提取時(shí)間等參數(shù)的優(yōu)化，建立了可快速同時(shí)測(cè)定化妝品中35種性激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法。本方法可分析的性激素種類多于現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道，且前處理步驟簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，能滿足高效率日常監(jiān)督抽檢的需要，可為化妝品中性激素檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；ST16臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；LC-250型超聲波清洗器(山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司)。

群勃龍(純度96.3%，下同)、勃地酮(98.8%)、諾龍(96.7%)、氧甲氫龍(99.0%)、睪酮(99.2%)、21-羥基孕酮(99.8%)、甲睪酮(97.7%)、雄烯二酮(99.3%)、17-α-羥基孕酮(99.5%)、氯司替勃(99.5%)、甲羥孕酮(99.0%)、孕酮(99.7%)、醋酸美倫孕酮(97.7%)、醋酸甲羥孕酮(99.0%)、醋酸氯睪酮(97.0%)、丙酸睪酮(99.7%)、雙酚A(99.8%)、17-β-雌二醇(95.4%)、17-α-雌二醇(99.3%)、雌酮(99.6%)、己烯雌酚(97.4%)、雙烯雌酚(96.6%)、己烷雌酚(99.14%)均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；炔諾酮(99.4%)、孕三烯酮(99.7%)、孕二烯酮(99.4%)、達(dá)那唑(99.2%)、醋酸氯地孕酮(100%)、己酸羥孕酮(99.8%)、苯丙酸諾龍(99.1%)、雌三醇(97.6%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；腎上腺甾酮(98%)、美雄酮(95%)均購(gòu)于Toronto Research Chemicals公司；表睪酮(1 mg/mL)購(gòu)于Cerilliant公司；炔諾孕酮(100%)購(gòu)于European Pharmacopoeia公司；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)默克公司)；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水(由美國(guó)密理博公司Milli-Q超純水機(jī)制備)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為水；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL。梯度洗脫程序：0～13 min，5%～35% A；13～14 min，35% A；14～15 min，35%～48% A；15～17 min，48% A；17～24 min，48%～85% A ；24～26 min，85% A；26～27 min，85%～5% A；27～31 min，5% A。

1.2.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI+和ESI-)；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；正離子噴霧電壓：3.2 kV；負(fù)離子噴霧電壓：2.8 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；進(jìn)樣錐氣體流速：150 L/h。35種性激素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 35種性激素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 35 sex hormones

1.3 樣品前處理

稱取均勻試樣0.2 g(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，加入2 mL乙腈，在渦旋儀上分散(水狀樣品渦旋1 min，乳狀樣品和霜狀樣品均渦旋2 min)，然后加入50%乙腈水溶液至近刻度，超聲提取20 min后取出。待樣品恢復(fù)至室溫后，用50%乙腈水溶液定容至刻度，搖勻，8 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.4 系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg(精確至0.01 mg)分別置于不同的10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，搖勻即得質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的各性激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取適量各性激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度約為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別取水狀、乳狀、霜狀基質(zhì)空白樣品各7份于10 mL容量瓶中，每份0.2 g(精確至0.000 1 g)，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“1.3”步驟進(jìn)行前處理，即得質(zhì)量濃度分別約為2、4、10、20、30、40、50 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-17]，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、90%甲醇水溶液、50%甲醇乙腈和50%乙腈水溶液5種提取溶劑的效果。稱取15份均勻的空白水狀樣品(每份約0.2 g)，分為5組(每組平行3份)，分別加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中各性激素的加標(biāo)量均為1.00 μg/g，分別采用上述提取溶劑進(jìn)行提取，其他操作按“1.3”進(jìn)行前處理，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，采用甲醇、乙腈、90%甲醇水溶液、50%甲醇乙腈和50%乙腈水溶液作為提取溶劑時(shí)，35種性激素的加標(biāo)回收率分別為73.7%～114%、68.4%～113%、73.5%～118%、77.4%～118%和81.4%～118%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.40%～8.1%、0.50%～8.7%、0.90%～10%、0.50%～10%和1.1%～9.5%。由于50%乙腈水溶液作為提取劑時(shí)35種性激素的回收率最好且RSD滿足分析要求，因此選擇提取溶劑為50%乙腈水溶液。

2.1.2 提取方式及提取時(shí)間的選擇分別考察了超聲、渦旋和振蕩3種方式的提取效果。稱取9份均勻的空白水狀樣品(每份約0.2 g)，分為3組(每組平行3份)，分別加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中各性激素的加標(biāo)量均為1.00 μg/g，分別采用上述提取方式進(jìn)行提取，其他操作按“1.3”進(jìn)行前處理，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，采用超聲、渦旋和振蕩方式進(jìn)行提取時(shí)，35種性激素的加標(biāo)回收率分別為87.0%～115%、84.3%～116%和80.9%～116%，RSD分別為2.7%～8.7%、1.3%～8.0%和0.60%～10%。超聲提取的回收率總體較好，且簡(jiǎn)便易操作，因此進(jìn)一步同法考察了超聲提取時(shí)間分別為10、20、30 min時(shí)35種性激素的回收率。結(jié)果顯示，超聲時(shí)間為10、20、30 min時(shí)，35種性激素的加標(biāo)回收率分別為76.4%～114%、89.7%～111%和84.6%～112%，RSD分別為0.50%～8.3%、0.10%～13%和0.20%～13%。超聲提取時(shí)間為20 min時(shí)的回收率最高。綜上，實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取20 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)3種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，在同等色譜條件下，35種性激素在CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)柱上的峰形對(duì)稱、尖銳，各母離子、子離子相同或相近的組分(表1中組分1和5、3和13、7和15、9和14、18和25、30和31、32和35)均能實(shí)現(xiàn)良好分離，可以準(zhǔn)確定性、定量。因此，選擇CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)柱進(jìn)行分離。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接灌注的進(jìn)樣方式，在正、負(fù)離子掃描模式下，對(duì)各性激素進(jìn)行全掃描，得到其母離子后，采用二級(jí)質(zhì)譜掃描確定各性激素的子離子，并進(jìn)一步優(yōu)化其錐孔電壓(CV)和碰撞能量(CE)。優(yōu)化的質(zhì)譜條件見(jiàn)“1.2.2”，此條件下35種性激素的穩(wěn)定性好，靈敏度高，其MRM圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性范圍與檢出限

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[8]及文獻(xiàn)報(bào)道[16]，選擇配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液以消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾。在優(yōu)化條件下，以定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/L)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限(LOD)，10倍信噪比計(jì)算方法定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，35種性激素在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99，LOD為0.028～0.117 μg/g，LOQ為0.093～0.352 μg/g(見(jiàn)表2)。

圖1 35種性激素的UPLC-MS/MS MRM譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS MRM chromatograms of 35 sex hormonesthe numbers denoted(1-35) were the same as those in Table 1

2.5 加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

稱取水狀、乳狀、霜狀3種基質(zhì)均勻空白樣品各18份(每份約0.2 g)于10 mL容量瓶中，分為3組(每組平行6份)，分別添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使3組樣品中各組分的加標(biāo)量分別為0.25、0.50、1.00 μg/g，按“1.3”處理樣品并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，水狀、乳狀基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率分別為84.5%～112%和84.0%～116%，RSD分別為1.7%～11%和1.5%～12%；霜狀基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率為84.0%～117%，RSD為2.1%～14%(見(jiàn)表2)。該方法回收率和重現(xiàn)性良好，準(zhǔn)確性高，適應(yīng)性好，可作為化妝品中35種性激素的檢測(cè)方法。

表2 35種性激素的線性范圍、檢出限、定量下限及霜狀樣品的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,LODs,LOQs of 35 sex hormones and spiked recoveries,RSDs(n=6) of cream sample

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

為評(píng)價(jià)方法的適用性，采用該方法對(duì)日常監(jiān)督抽檢中的15批化妝品(含水狀、乳狀、霜狀化妝品各5批)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果均為未檢出，樣品中的雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)峰均無(wú)干擾，可準(zhǔn)確定性、定量。使用本方法進(jìn)行測(cè)定，前處理時(shí)間約1 h，上機(jī)分析時(shí)間為31 min，相較于其他分析方法更適合化妝品中多種性激素的快速篩查。

3 結(jié) 論

本文建立的同時(shí)測(cè)定化妝品中35種性激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，相較于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)及文獻(xiàn)報(bào)道中性激素的檢測(cè)方法，增加了性激素的檢測(cè)種類，且前處理簡(jiǎn)便快捷、分析時(shí)間短、適應(yīng)性強(qiáng)，適應(yīng)于現(xiàn)今高效日常監(jiān)管的理念，可為化妝品中35種性激素的大批量日常監(jiān)督抽檢和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供科學(xué)依據(jù)。