劉永濤，沈丹怡，董 靖，楊秋紅，楊移斌，周 順，艾曉輝*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141；3.湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223；4.浙江省慈溪市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，浙江 慈溪 315300)

氯硝柳胺(Niclosamide，NIC)，又名殺螺胺、貝螺殺、清塘凈等，是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用的滅螺劑。在我國氯硝柳胺主要用于殺滅血吸蟲傳播的中間宿主釘螺，自1992年世界銀行貸款中國血吸蟲病控制項(xiàng)目實(shí)施以來，每年用藥量約3 200 t以上，大量氯硝柳胺在江湖洲灘長期反復(fù)使用[1]。氯硝柳胺在我國也被批準(zhǔn)用作清塘劑殺滅釘螺、椎實(shí)螺和野雜魚等[2]。研究表明，氯硝柳胺對魚類、蚤類、蝌蚪、螺類等具有明顯毒性[3]。Abreu等[4]通過研究氯硝柳胺與小牛胸腺DNA的相互作用，證實(shí)氯硝柳胺能引起DNA的損傷。Ostrosky-Wegman等[5]研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)人類血液樣品中有2個(gè)樣品的碎屑形成與氯硝柳胺呈劑量相關(guān)增長。氯硝柳胺在人體內(nèi)也能誘導(dǎo)產(chǎn)生血管舒張相關(guān)的副作用[6]。持續(xù)大范圍、大劑量使用氯硝柳胺對生態(tài)環(huán)境和消費(fèi)者身體健康的影響日益受到人們關(guān)注，同時(shí)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中氯硝柳胺的投毒案件也時(shí)有發(fā)生[7]，因此，建立一種對環(huán)境水體、底泥、魚和蝦中氯硝柳胺準(zhǔn)確定性定量的分析方法是十分必要的。

目前對環(huán)境水體中氯硝柳胺的測定方法主要有高效液相色譜法[8]、衍生化氣相色譜-質(zhì)譜法[7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]；底泥中氯硝柳胺的測定方法有加速溶劑萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]；水產(chǎn)品中氯硝柳胺的測定方法主要有氣相色譜法[13]、高效液相色譜法[14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17]。氣相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜法需進(jìn)行硅烷化衍生處理，且樣品前處理過程繁瑣；液相色譜法分析氯硝柳胺易出現(xiàn)假陽性，且檢出限高；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，但存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，且不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)差別較大。同位素稀釋結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)是有效減少基質(zhì)效應(yīng)的方法[18-19]。因此，本文以氯硝柳胺的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物氯硝柳胺-13C6(NIC-13C6)為內(nèi)標(biāo)，建立了檢測環(huán)境水體、底泥、魚和蝦中氯硝柳胺的同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。與前述文獻(xiàn)方法相比，該方法具有靈敏度和準(zhǔn)確度高、樣品制備簡單、無基質(zhì)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access Max液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Fisher Scientific公司)；HITACHI 20PR-520型自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；Mettler-Toledo AE-240電子天平(梅特勒-托利多公司)；FS-1高速勻漿機(jī)(華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)；調(diào)速混勻器(上?？等A生化儀器制造廠)；氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；HQ-60-Ⅱ 旋渦混合器(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；HGC-12氮吹儀(上海HENGAO T&D公司)。

氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥96%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)、氯硝柳胺-13C6-水合物標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%，德國Witega公司)；十八烷基硅膠(C18)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(40～60 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；多壁碳納米管(MWCNTs)(外徑：8～15 nm，純度>95%，長度<50 μm，北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司)；乙腈、甲醇、水(色譜純，美國J.T.Baker公司)，氨水、無水硫酸鈉、氯化鈉(分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；0.1%氨水乙腈：1 000 mL乙腈中加入2 mL 50%氨水，混勻即得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量氯硝柳胺、氯硝柳胺-13C6-水合物標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈分別溶解并定容，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱中保存。分別用乙腈-水(70>∶30,體積比)將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4 ℃冰箱中保存。

用乙腈-水(70>∶30)稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液，得到含氯硝柳胺質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L，且含氯硝柳胺-13C6質(zhì)量濃度均為10 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

采用“1.3”的方法制備水樣、底泥、黃顙魚自然比例帶皮肌肉和克氏原螯蝦肌肉空白樣品溶液，用空白樣品溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液，得氯硝柳胺質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L，且含氯硝柳胺-13C6質(zhì)量濃度均為10 μg/L的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 水樣移取200 mL水樣于500 mL分液漏斗中，加入10 μL 1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，再加入8 g氯化鈉，振搖分液漏斗使其溶解。加入氨水調(diào)節(jié)水樣的pH為9.5±0.5，再加入40 mL乙酸乙酯劇烈振蕩混勻2 min，靜置30 min，取上層乙酸乙酯層于雞心瓶中，用乙酸乙酯重復(fù)提取1次。將乙酸乙酯層合并于雞心瓶中，置于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用4 mL乙腈分2次溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至10 mL離心管中，置于50 ℃氮吹儀上氮吹至干，加入1 mL乙腈-水(70>∶30)定容，渦旋振蕩30 s，7 000 r/min離心5 min，過0.22 μm尼龍有機(jī)濾頭后待分析。

1.3.2 底泥去除底泥樣品中的樹枝、石頭等雜物后烘干。稱取5 g粉碎的干燥樣品于50 mL離心管中，加入3 mL蒸餾水，渦旋振蕩1 min，再加入20 μL 1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液和7 mL 0.1%氨水乙腈，渦旋振蕩30 s，再加入3 g無水硫酸鎂渦旋振蕩1 min，7 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移提取液至15 mL離心管中，重復(fù)提取1次，合并提取液，用乙腈定容至15 mL，再加入300 mg C18粉，渦旋振蕩30 s，7 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取7.5 mL提取液至10 mL離心管中，置于50 ℃氮吹儀上氮吹至干，用1 mL乙腈-水(70>∶30)溶解殘?jiān)瑴u旋振蕩30 s，7 000 r/min離心5 min，取離心后的液體過0.22 μm尼龍有機(jī)濾頭后待分析。

1.3.3 魚、蝦樣品分別稱取5 g黃顙魚自然比例帶皮肌肉和克氏原螯蝦肌肉樣品，置于50 mL離心管中，依次加入20 μL 1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液和7 mL 0.1%氨水乙腈，后續(xù)步驟與“1.3.2”相同。

1.4 色譜與質(zhì)譜分析條件

色譜條件：色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃，流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為乙腈，B為水；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相洗脫梯度：0～2.0 min，50% A；2.0～2.5 min，50%～90% A；2.5～6.5 min,90%A;6.5～6.6 min，90%～50% A；6.6～7.5 min，50% A。

質(zhì)譜條件：離子化模式：加熱大氣壓電噴霧離子源(HESI)，選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式進(jìn)行檢測，負(fù)離子模式噴霧電壓：-3 000 V，源內(nèi)解離電壓：0 V，蒸發(fā)氣溫度：200 ℃，鞘氣壓力：344.7 kPa，輔助氣壓力：34.5 kPa，碰撞氣及壓力：氬氣，0.195 Pa，離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃，Q1 PW 0.4，Q3 PW 0.7。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將5.0 μg/mL的氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)溶液以10 μL/min的速度注射到質(zhì)譜儀，分別對其母離子進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6在負(fù)離子模式下產(chǎn)生更多的[M-H]-分子離子，這與兩者含有高電負(fù)性的氯原子有關(guān)[18]，母離子分別為m/z324.9和331.0，因此選擇在負(fù)離子模式下進(jìn)行分析。然后以子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，分別找出其定量和定性子離子及對應(yīng)的碰撞能量，結(jié)果見表1。氯硝柳胺的產(chǎn)物離子分別為m/z289.0和171.1，分別由氯硝柳胺損失1個(gè)HCl和[324.9-HCl]-損失1個(gè)C7H3O2得到；氯硝柳胺-13C6則損失1個(gè)HCl產(chǎn)生m/z294.9的子離子和[331.0-HCl]-損失1個(gè)C7H3O2產(chǎn)生m/z176.9的子離子。

與電噴霧離子源(ESI)相比，HESI采用設(shè)定蒸發(fā)氣溫度來提高輔助氣溫度進(jìn)而起到加熱的作用，因而離子化效率和重現(xiàn)性比ESI源好，且靈敏度有所提高[19]。本研究比較了HESI不同蒸發(fā)氣溫度(50、100、200、350、450 ℃)對10 μg/L目標(biāo)物檢測靈敏度和鞘氣壓力的影響。結(jié)果顯示，隨著HESI蒸發(fā)氣溫度的提高，氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6的峰面積均有提高，鞘氣壓力也隨之增加。蒸發(fā)氣溫度為450 ℃時(shí)兩者的峰面積分別約為50 ℃時(shí)的2.2倍、2.5倍，鞘氣壓力約為50 ℃時(shí)的2.1倍?？紤]到鞘氣壓力升高需要消耗更多的氮?dú)?，同時(shí)兼顧檢測靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選擇蒸發(fā)氣溫度為200 ℃。

表1 目標(biāo)化合物的SRM監(jiān)測離子對及其質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for SRM monitoring ion pairs of target compounds

2.2 色譜條件的優(yōu)化

目前，液相色譜-質(zhì)譜法分析氯硝柳胺的流動(dòng)相有乙腈-0.1%氨水[9]、乙腈-0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液[17]、乙腈-水[8,11,15-16]和甲醇-水[10,12]。本實(shí)驗(yàn)對上述流動(dòng)相進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%氨水或乙腈-0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6的保留時(shí)間易漂移，且目標(biāo)物的離子化也不穩(wěn)定，導(dǎo)致連續(xù)兩次測定同一樣品時(shí)目標(biāo)物的峰面積相差較大，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相同[15-16]。而以乙腈-水為流動(dòng)相比以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的響應(yīng)度高，因此最終選擇乙腈-水為流動(dòng)相。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取劑的選擇水樣中氯硝柳胺的提取劑有非離子表面活性劑Triton X-114[8]、離子對試劑[C8MIM][PF6]-乙腈[9]、乙腈-二氯甲烷[11]和三氯甲烷[13]。但Triton X-114和[C8MIM][PF6]的價(jià)格較高，且可處理的水樣體積較小導(dǎo)致檢出限較高；二氯甲烷和三氯甲烷的毒性較大，且濃縮過程中易爆沸。此外，由于氯硝柳胺的pKa為7.3，呈弱堿性，堿性環(huán)境有利于氯硝柳胺呈分子狀態(tài)，從而更易溶于非極性溶劑乙酸乙酯中。因此，本方法先將水樣的pH調(diào)至堿性，再以毒性小且沸點(diǎn)較高的乙酸乙酯作為提取劑進(jìn)行提取。

廖且根等[12]采用乙腈-水作為萃取溶劑，中性氧化鋁、硅藻土作為吸附材料，利用加速溶劑萃取儀對底泥樣品中的氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物進(jìn)行提取。該方法需專門提取設(shè)備，提取過程較復(fù)雜。水產(chǎn)品中氯硝柳胺的提取劑多采用氨化乙腈[15-17]，但上述文獻(xiàn)只給出氨化乙腈的pH值。由于乙腈為有機(jī)溶劑，用氨水調(diào)節(jié)pH時(shí)其pH值難于測定，因此比較了在乙腈中添加不同體積分?jǐn)?shù)(0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1%)氨水對底泥、黃顙魚自然比例帶皮肌肉和克氏原螯蝦肌肉中氯硝柳胺加標(biāo)(5 μg/kg)提取回收率的影響。結(jié)果表明，乙腈中添加0.1%氨水時(shí)，氯硝柳胺的提取回收率最高(約為79.7%)。因此，水樣以乙酸乙酯作為提取劑，底泥、魚、蝦以0.1%氨水乙腈作為提取劑。

圖1 不同吸附劑對樣品提取液的凈化作用Fig.1 Effects of different adsorbents on extraction solutions

2.3.2 凈化吸附劑及其用量的選擇底泥和魚、蝦基質(zhì)復(fù)雜，底泥中含有腐殖質(zhì)和色素等雜質(zhì)，魚、蝦含有脂肪和蛋白質(zhì)等，因此樣品在提取后需進(jìn)一步凈化。在底泥、黃顙魚自然比例帶皮肌肉、克氏原螯蝦肌肉空白樣品中分別添加氯硝柳胺，使其加標(biāo)濃度為5 μg/kg。按照“1.3”方法進(jìn)行提取后，以回收率作為評價(jià)指標(biāo)，分別考察了100 mg的MWCNTs、C18和PSA對提取液的凈化效果(見圖1)。結(jié)果顯示，C18對底泥、黃顙魚、克氏原螯蝦肌肉樣品提取液的凈化效果最優(yōu)，PSA最差。這是由于PSA吸附劑的硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團(tuán)，與氨基(NH2)吸附劑相似，因此對氯硝柳胺的吸附作用最大。進(jìn)一步對比了不同用量C18(100、200、300 mg)對提取液的凈化效果，結(jié)果表明，C18用量為300 mg時(shí)的凈化效果最優(yōu)，因此選擇300 mg C18作為凈化吸附劑。

2.4 線性關(guān)系

2.4.1 溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線將“1.2”制備的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，以氯硝柳胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)，氯硝柳胺與氯硝柳胺-13C6的峰面積比為縱坐標(biāo)(y)，繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，氯硝柳胺在0.2～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程為y=0.192 2x+0.022 5，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 5。

2.4.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線將“1.2”制備的水樣、底泥、黃顙魚自然比例帶皮肌肉、克氏原螯蝦肌肉空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以氯硝柳胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)，樣品中氯硝柳胺與氯硝柳胺-13C6的峰面積比為縱坐標(biāo)(y)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，氯硝柳胺在0.2～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程分別為y水樣=0.188 5x水樣-0.069 6，y底泥=0.167 1x底泥-0.101 6，y魚=0.178 6x魚-0.021 7和y蝦=0.191 2x蝦+0.023 3，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.999 6、0.999 8、0.999 7和0.999 9。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在生物樣品分析中普遍存在基質(zhì)效應(yīng)。同位素內(nèi)標(biāo)與待測物結(jié)構(gòu)相似，在色譜和質(zhì)譜上的特征相似，不但可抵消質(zhì)譜離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，還可消除樣品前處理過程中的差異。本研究采用氯硝柳胺-13C6作為內(nèi)標(biāo)，以水樣、底泥、黃顙魚自然比例帶皮肌肉和克氏原螯蝦肌肉的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與氯硝柳胺溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來考察基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式為[1-(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)]×100%，若為負(fù)值，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)作用，為正值則表明存在基質(zhì)抑制作用[20]。結(jié)果顯示，上述4種基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值分別為0.98、0.87、0.93、0.99，表明4種基質(zhì)對氯硝柳胺均為抑制作用。且斜率比值在0.8～1.2范圍內(nèi)，說明4種基質(zhì)對氯硝柳胺無基質(zhì)效應(yīng)[21]。因此，本文采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線對氯硝柳胺進(jìn)行定量。

2.6 方法回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限與定量下限

在空白水樣中添加2.5、25、250 ng/L 3個(gè)水平的氯硝柳胺，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行樣品，按照“1.3.1”進(jìn)行樣品前處理，“1.4”條件進(jìn)行測定，得3個(gè)加標(biāo)水平下氯硝柳胺的平均回收率為90.5%～109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%～11%。在空白底泥、黃顙魚自然比例帶皮肌肉和克氏原螯蝦肌肉中分別添加0.5、5.0、50 μg/kg的氯硝柳胺，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行樣品，按照“1.3.2”和“1.3.3”進(jìn)行樣品前處理，“1.4”條件進(jìn)行測定，得3種樣品的平均回收率分別為89.4%～113%、92.8%～110%和94.1%～107%，RSD分別為4.6%～12%、2.8%～11%和3.2%～9.3%。

分別以大于3倍和10倍信噪比計(jì)算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，氯硝柳胺在水樣中的LOD為1.0 ng/L，LOQ為2.5 ng/L，底泥、黃顙魚自然比例帶皮肌肉和克氏原螯蝦肌肉樣品的LOD為0.2 μg/kg，LOQ為0.5 μg/kg?？瞻S顙魚自然比例帶皮肌肉及加標(biāo)回收樣品(5 μg/kg)的SRM色譜圖見圖2。

2.7 方法應(yīng)用

將該方法用于一個(gè)有大量死魚且懷疑是由氯硝柳胺中毒所致的池塘中底泥、水體和魚體樣品的測定，結(jié)果表明在送檢的池塘底泥、水體、黃顙魚和草魚自然比例帶皮肌肉樣品中檢出氯硝柳胺，其含量分別為108.5 μg/kg、12.7 μg/L、58.1 μg/kg和19.6 μg/kg。

3 結(jié) 論

本文采用同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了環(huán)境水體、底泥、魚和蝦中氯硝柳胺的分析方法。該方法樣品前處理簡單快速，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，可為開展氯硝柳胺在環(huán)境水體、底泥、魚、蝦中殘留量監(jiān)測和富集遷移規(guī)律研究提供技術(shù)支撐，亦可為水產(chǎn)養(yǎng)殖中由氯硝柳胺引起魚體中毒事件提供一種有效的檢測識(shí)別方法。