楊 明，伊 鋆，陳 丹，王夢(mèng)穎，許 晴，田 甜，管卓龍，侯 靖，周 原，劉 坤，王冬梅，胡筱靜，盧躍鵬，江小明，涂鳳琴

(武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430012)

我國是蜂蜜的生產(chǎn)大國之一[1]。獸藥在防治疾病、降低病死率、提高養(yǎng)殖效率和保障產(chǎn)品產(chǎn)量等方面發(fā)揮了巨大作用，有效推動(dòng)了蜜蜂養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展。然而獸藥使用不合理、禁限用獸藥濫用等問題時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致蜂產(chǎn)品中存在一定程度的獸藥殘留，從而影響人體健康，甚至阻礙我國蜂蜜的出口。林可酰胺類獸藥主要包括林可霉素和克林霉素，其對(duì)厭氧菌作用強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陽性菌等有效。大環(huán)內(nèi)酯類獸藥根據(jù)內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)母核上碳數(shù)分為14、15和16三類，對(duì)需氧型革蘭氏菌具有廣泛作用。這兩類獸藥在防治蜜蜂疾病方面效果好，特別是針對(duì)蜜蜂的美洲幼腐病等，從而被廣泛用于蜜蜂疾病的預(yù)防和治療[2]。但不合理使用和不遵守休藥期等會(huì)造成蜂蜜獸藥殘留問題，進(jìn)而引起人體腸道紊亂、腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)，損害前庭和耳蝸神經(jīng)，甚至造成肝腎嚴(yán)重?fù)p傷[3-5]。目前關(guān)于蜂蜜中林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的限量，世界各國暫未明確。因此，建立蜂蜜中林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的分析方法對(duì)于監(jiān)測蜂蜜中獸藥殘留情況以及保障蜂蜜的食品安全具有實(shí)際意義。

目前，林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的測定方法主要有液相色譜法(HPLC)[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[7-9]。HPLC法前處理復(fù)雜、定性能力較弱，靈敏度低；HPLC-MS/MS法的選擇性和靈敏度高，抗干擾性強(qiáng)，在食品、環(huán)境和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。前處理技術(shù)主要采用固相萃取法，但操作步驟繁瑣、試劑用量大，不適于批量樣品檢測。傳統(tǒng)QuEChERS法多采用C18、PSA和GCB等吸附材料單獨(dú)或聯(lián)用的方式進(jìn)行凈化處理，但對(duì)于蜂蜜樣品的處理效果均不理想。

氧化鋅(ZnO)是一種新型吸附劑，其帶隙寬、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，由于原子的反應(yīng)性高，通過共用電子可引起較強(qiáng)的分子間作用力，從而產(chǎn)生吸附效應(yīng)。同時(shí)其比表面積和吸附容量大，目前在吸附廢水中有機(jī)物[10]和重金屬[11]等方面應(yīng)用廣泛，而在食品中的應(yīng)用未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用新材料ZnO與N-丙基乙二胺(PSA)按照一定配比，基于QuEChERS原理對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合HPLC-MS/MS的高靈敏度和強(qiáng)抗基質(zhì)干擾等特點(diǎn)，建立了蜂蜜中7種林可酰胺類以及大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的快速檢測方法。該方法操作簡單，重復(fù)性好，分析快速，針對(duì)蜂蜜中獸藥殘留問題提供了可靠的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX 4500 Triple Quad質(zhì)譜儀(配Turbo V離子源，美國 AB SCIEX公司)；LC 30A液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；超聲波清洗器(美國 Kudos公司)。

林可霉素(CAS：154-21-2)、克林霉素(CAS：18323-44-9)、替米考星(CAS：108050-54-0)、紅霉素(CAS：114-07-8)、羅紅霉素(CAS：80214-83-1)、螺旋霉素(CAS：8025-81-8)、吉他霉素(CAS：1392-21-8)均為First Standard標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥97.0%。

乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸銨、甲酸、氨水(均為HPLC級(jí)，購于GER Merck KgaA集團(tuán))；石墨化炭黑(GCB)、氨基(NH2)吸附劑、中性氧化鋁(Al2O3-N)、N-丙基乙二胺(PSA)、氧化鋯(ZrO2)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、氧化鋅(ZnO)和弗羅里硅土(Florisil)(購于GER CNW公司)；磷酸氫二鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂和無水硫酸鈉(均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取一定量的7種待測獸藥標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃下儲(chǔ)存。臨用時(shí)以空白樣品基質(zhì)提取液配制成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品置于50 mL離心管中，加入3 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)，渦旋使其充分溶解，再加入2 g無水硫酸鈉和10 mL 1%氨水乙腈，渦旋振蕩，超聲15 min后離心(3 900 r/min)3 min。取全部上清液于15 mL離心管(預(yù)先裝有80 mg ZnO+20 mg PSA)中，渦旋1 min，離心后過聚四氟乙烯(0.22 μm)濾膜待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters XBridge C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。梯度洗脫程序：0～1.0 min，5% B；1.0～3.5 min，5%～45% B；3.5～5.5 min，45%～90% B；5.5～8.0 min，90% B；8.0～8.1 min，90%～5% B；8.1～11.0 min，5% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離正離子模式(ESI+)；霧化氣(GS1)和輔助氣(GS2)壓力均為344 750 Pa(50 psi)；離子源溫度(TEM)：500 ℃；氣簾氣壓力(CUR)：172 375 Pa(25 psi)；電離電壓(IS)：5 000 V；碰撞氣體(CAD)：Medium；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用針泵進(jìn)樣將100 ng/mL的7種待測獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀，分別將母離子在ESI+和ESI-兩種模式下進(jìn)行全掃描，結(jié)果顯示ESI+模式下7種待測物的離子信號(hào)穩(wěn)定、響應(yīng)高，因此選擇ESI+掃描模式。在該模式下7種化合物均產(chǎn)生[M+H]+、[M+2H]2+的母離子。再進(jìn)一步掃描產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子，選取其中豐度比最高的2個(gè)作為定性、定量分析的離子對(duì)。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 7種林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 7 lincosamide and macrolide veterinary drugs

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用Waters XBridge C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)色譜柱，在ESI+模式下，比較了7種目標(biāo)物在乙腈-水與甲醇-水流動(dòng)相體系中的色譜行為。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7種目標(biāo)物在乙腈-水流動(dòng)相中的峰形和響應(yīng)均優(yōu)于甲醇-水，且洗脫時(shí)間短，故選擇乙腈-水流動(dòng)相體系。

流動(dòng)相中加入適量揮發(fā)性鹽或酸，可以提高檢測物的響應(yīng)值、分辨率和改善峰形[12]。因此，在水相中加甲酸或乙酸銨進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相體系的條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因7種目標(biāo)物離子化后主要以[M+H]+或[M+2H]2+的形式存在，故在水相中加入甲酸時(shí)，各目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)高，且以加入0.1%甲酸時(shí)的效果最佳；而在水相中加入1.0、2.0、5.0 mmol/L乙酸銨時(shí)，各目標(biāo)物的響應(yīng)均有所降低。因此，實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的極性較大，易溶于極性溶劑[13-14]，因此實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯和丙酮作為提取溶劑時(shí)的提取效率。結(jié)果顯示，甲醇提取液的水分較多且不易分層，不利于目標(biāo)物的分析；乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，回收率偏低；丙酮作為提取溶劑時(shí)，揮發(fā)性較強(qiáng)，且直接進(jìn)樣會(huì)損傷管道和質(zhì)譜元件；而乙腈對(duì)糖的溶解性較小且有沉淀蛋白的作用[15]，各目標(biāo)物的回收率均優(yōu)于甲醇、乙酸乙酯和丙酮。故實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑，進(jìn)一步考察了純乙腈、5%氨水乙腈、2%氨水乙腈、1%氨水乙腈、5%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈和1%甲酸乙腈的提取效果。結(jié)果表明：7種目標(biāo)化合物在上述提取溶劑中的平均回收率無明顯差異，分別為81.2%、79.9%、83.3%、88.5%、74.9%、78.4%和73.6%，但林可霉素以2%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈為提取溶劑時(shí)的回收率分別為49.1%和22.2%；紅霉素以5%甲酸乙腈為提取溶劑時(shí)的回收率僅為25.0%。相比之下1%氨水乙腈作為提取溶劑時(shí)的平均回收率最高，特別是林可霉素的回收率均高于其它6種提取溶劑，且7種目標(biāo)物的回收率在76.9%～102%之間，完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此實(shí)驗(yàn)采用1%氨水乙腈作為提取溶劑。

2.4 吸附劑的優(yōu)化

蜂蜜含有豐富的糖類、氨基酸、有機(jī)酸和少量蛋白質(zhì)等[16]，可能影響目標(biāo)化合物的測定，同時(shí)還會(huì)污染離子源。因此實(shí)驗(yàn)考察了質(zhì)量均為100 mg的PSA、C18、GCB、NH2、Al2O3-N和Florisil等QuEChERS 常用凈化劑，以及ZrO2和ZnO等新材料對(duì)目標(biāo)化合物的凈化效果和回收率。

圖1 不同吸附劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.1 Effect of different adsorbents on the recoveries of the target analytes

圖2 不同吸附劑組合對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of combinations of different adsorbents on the recoveries of the target analytes

結(jié)果表明(見圖1)，ZrO2作為能有效吸附磷脂類物質(zhì)的吸附劑，同時(shí)也能吸附目標(biāo)物，而蜂蜜基質(zhì)中不含磷脂類物質(zhì)，因此各目標(biāo)物的平均回收率最低，僅為7.69%；PSA、C18、GCB、NH2、Al2O3-N、Florisil和ZnO作為吸附劑時(shí)各目標(biāo)物的平均回收率分別為72.2%、56.5%、68.3%、68.7%、67.9%、60.0%和67.2%，經(jīng)各吸附劑凈化后個(gè)別目標(biāo)物的回收率偏低，可能是吸附劑對(duì)各目標(biāo)物均有不同程度的吸附。通過分析發(fā)現(xiàn)，PSA作為吸附劑時(shí)螺旋霉素和吉他霉素的回收率較低(分別為30.9%和24.9%)，而其它5種目標(biāo)物的回收率均在83.9%～93.3%之間；ZnO作為吸附劑時(shí)能有效吸附蜂蜜基質(zhì)中的糖類物質(zhì)，其中螺旋霉素和吉他霉素的回收率達(dá)到最高(分別為90.5%和91.5%)，而林可霉素、紅霉素和羅紅霉素的回收率分別為28.7%、44.9%和44.4%?？赡苡捎赯nO的吸附能力強(qiáng)且用量較高從而吸附部分目標(biāo)物，導(dǎo)致其回收率偏低。

進(jìn)一步考察了不同比例的ZnO和PSA兩種吸附劑組合的凈化效果(見圖2)。結(jié)果表明，提取液經(jīng)組合吸附劑凈化后的效果好，各目標(biāo)物的平均回收率均顯著提高，同時(shí)有效降低了單一吸附劑對(duì)不同目標(biāo)物的吸附。其中80 mg ZnO+20 mg PSA 的凈化效果最好，各目標(biāo)物的回收率為75.4%～96.7%，平均回收率為85.6%，均優(yōu)于其它組合。故實(shí)驗(yàn)最終采用 80 mg ZnO+20 mg PSA的組合吸附劑對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.5 鹽析劑的優(yōu)化

蜂蜜基質(zhì)含有18%～22%水分，且在前處理時(shí)需加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值和溶解基質(zhì)樣品，故在樣品提取時(shí)應(yīng)加入鹽析劑使有機(jī)相和水相分層，以達(dá)到除水目的。NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的鹽析劑，實(shí)驗(yàn)分別考察了2 g NaCl、2 g MgSO4、2 g Na2SO4、1 g NaCl+1 g MgSO4、1 g NaCl+1 g Na2SO4、1 g MgSO4+1 g Na2SO46種鹽析劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明，NaCl、MgSO4、NaCl+MgSO4、NaCl+Na2SO4、MgSO4+Na2SO4作為鹽析劑時(shí)的平均回收率分別為68.8%、64.4%、53.0%、68.6%、60.4%，各目標(biāo)化合物的平均回收率偏低，其中林可霉素、螺旋霉素和吉他霉素的回收率不滿足實(shí)驗(yàn)要求；而Na2SO4作為鹽析劑時(shí)的平均回收率為87.4%，且林可霉素、螺旋霉素和吉他霉素的回收率明顯提升。因此實(shí)驗(yàn)選擇2 g Na2SO4作為鹽析劑。

2.6 其他條件的選擇

蜂蜜樣品富含有機(jī)酸而呈弱酸性，林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥可穩(wěn)定于pH 6～8溶液中，在酸性或堿性條件下均不穩(wěn)定，特別是林可霉素、紅霉素和螺旋霉素對(duì)酸比較敏感，在酸性條件下易降解。故采用pH 8的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)蜂蜜樣品pH值至中性，同時(shí)也能起到水解蜂蜜樣品和沉淀蛋白的作用，并有效避免目標(biāo)物在提取過程中降解，從而提升回收率?？疾炝颂砑硬煌w積磷酸鹽緩沖液(3、4、5、6、7、8、9 mL)對(duì)樣品溶液pH值的影響，結(jié)果顯示，樣品溶液pH值隨磷酸鹽緩沖液添加量的變化不大，均在7～8之間，因此實(shí)驗(yàn)選擇添加3 mL磷酸鹽緩沖液。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.22 μm尼龍濾膜對(duì)替米考星和螺旋霉素存在明顯吸附，影響其回收率，而0.22 μm的聚四氟乙烯(PTFE)濾膜對(duì)目標(biāo)物無明顯吸附現(xiàn)象，因此實(shí)驗(yàn)采用PTFE材料的過濾膜。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指目標(biāo)化合物在離子化時(shí)受到基質(zhì)干擾物的競爭引起分析信號(hào)變化從而導(dǎo)致增強(qiáng)或抑制的效應(yīng)。采用下式評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)：ME=K1/K2，其中K1和K2分別為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，當(dāng)ME>1.15時(shí)，表明產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME<0.85時(shí)，表明產(chǎn)生基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME為0.85～1.15時(shí)，說明基質(zhì)效應(yīng)不明顯[17]。實(shí)驗(yàn)對(duì)7種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，林可霉素、克林霉素、替米考星和螺旋霉素的基質(zhì)效應(yīng)分別為1.17、1.27、1.64和1.62，均大于1.15，說明存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；而紅霉素、羅紅霉素和吉他霉素的基質(zhì)效應(yīng)均在0.85～1.15之間。本實(shí)驗(yàn)使用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用于校準(zhǔn)曲線，以減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測定結(jié)果的影響。

2.8 方法學(xué)考察

以空白基質(zhì)提取液配制系列質(zhì)量濃度的7種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行測定，以所得峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，7種目標(biāo)化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均不小于0.999 3。分別以信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限(LOD)，信噪比為10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)，7種目標(biāo)化合物的LOD為0.21～0.35 μg/kg，LOQ為0.69～1.16 μg/kg(見表2)。

選擇陰性樣品進(jìn)行5.0、10.0、20.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平做6個(gè)平行，7種目標(biāo)化合物的平均回收率為75.5%～99.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.78%～5.9%(見表2)。本方法回收率和精密度高，符合蜂蜜中7種獸藥殘留的監(jiān)測要求。

表2 7種分析物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear relations,limits of detection,limits of quantitation,recoveries and relative standard deviations of 7 analytes(n=6)

圖3 陽性樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of a positive sample

2.9 實(shí)際樣品測定

采用該方法對(duì)從市場上隨機(jī)抽取的28批次蜂蜜樣品進(jìn)行了測定，其中1批次樣品檢出林可霉素，檢出量為5.80 μg/kg，其余27批次蜂蜜樣品均未檢出。陽性樣品的色譜圖如圖3所示。

3 結(jié) 論

針對(duì)蜂蜜的基質(zhì)特點(diǎn)，結(jié)合現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道，本研究改進(jìn)傳統(tǒng)QuEChERS技術(shù)以減少蜂蜜基質(zhì)的干擾，以1%氨水乙腈為提取溶劑，80 mg ZnO+20 mg PSA為吸附劑，通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件等，建立了基于QuEChERS前處理技術(shù)的同時(shí)快速測定蜂蜜中7種林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。相比于GB/T 23408-2009[18]和SN/T 1777.2-2007[19]等標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法操作步驟少，簡單快速、成本低，靈敏可靠，重現(xiàn)性好，同時(shí)補(bǔ)充了蜂蜜中林可酰胺類獸藥殘留的定量檢測方法，可為蜂蜜的質(zhì)量安全監(jiān)測提供技術(shù)支持。