王力敏　王東陽　王丹　王海燕　王紅巖　王雪君　王斌　王旭初

摘 要 以‘華南8號木薯塊根膨大期的韌皮部和木質(zhì)部為材料，采用改進(jìn)酚抽法提取總蛋白，進(jìn)行一維和二維電泳，電泳圖譜經(jīng)Image Master分析，得到差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明：改進(jìn)酚抽法可以從木薯塊根韌皮部和木質(zhì)部中提取高質(zhì)量總蛋白，用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究；獲得分離性好、分辨率及重復(fù)性較高的雙向電泳圖譜；比較木薯塊根韌皮部和木質(zhì)部雙向電泳圖譜發(fā)現(xiàn)265個差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中29個在韌皮部特異表達(dá)，17個在木質(zhì)部特異表達(dá)；成功鑒定出8種差異蛋白，這些蛋白主要參與翻譯后修飾、無機(jī)離子和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、分子伴侶和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝通路。本研究初步比較木薯塊根韌皮部和木質(zhì)部的蛋白表達(dá)差異性，為進(jìn)一步從蛋白質(zhì)組水平研究木薯塊根膨大過程中淀粉轉(zhuǎn)運(yùn)、積累和合成調(diào)控機(jī)制奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 木薯；塊根；韌皮部；木質(zhì)部；比較蛋白質(zhì)組學(xué)；質(zhì)譜分析

中圖分類號 S533 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）是多年生熱帶亞熱帶淀粉作物，木薯塊根為其主要營養(yǎng)貯藏器官，淀粉含量高達(dá)40%，是南美洲、非洲、亞洲發(fā)展中國家重要的糧食來源[1-2]。除食用外，木薯淀粉還可以用作生產(chǎn)變性淀粉、酒精、山梨醇等工業(yè)原料，用途十分廣泛[3]。鑒于其巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提高木薯產(chǎn)量及淀粉含量便成為各國木薯基礎(chǔ)研究的重要目標(biāo)。

木薯塊根淀粉合成和調(diào)控機(jī)制已在生理和基因工程方面取得了一定的研究進(jìn)展。研究人員對木薯塊根發(fā)育及淀粉積累做了一些生理方面的研究[4-5]，并運(yùn)用基因工程手段來改變木薯根部淀粉合成相關(guān)基因如AGPase、SBE等的表達(dá)水平[6-8]，對塊根中一些淀粉積累相關(guān)基因做了初步研究[9-10]。但在蛋白質(zhì)組水平上的研究報(bào)道相對較少。有少數(shù)研究者對木薯根部的蛋白表達(dá)做了初步研究，如Sheffield等[11]對木薯的塊根和須根做了比較蛋白組學(xué)分析；Li等[12]利用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-ESI-MS/MS）從華南8號（SC8）木薯體細(xì)胞胚胎、幼苗和塊根組織中分離鑒定出383種蛋白，并對已鑒定蛋白的功能分類和組織特異性進(jìn)行分析，為從“組學(xué)”方法上大規(guī)模、系統(tǒng)性研究木薯提供了借鑒；施涯鄰等[13]對木薯根、莖、葉組織的蛋白提取方法進(jìn)行改進(jìn)，將SDS提取法和TCA-丙酮法相結(jié)合可以制備出適合雙向電泳的蛋白樣品。目前，有關(guān)木薯的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中在不同組織器官上，而對木薯塊根韌皮部和木質(zhì)部進(jìn)行細(xì)致的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究則鮮有報(bào)道。

在高等植物中，韌皮部含有篩管和伴胞復(fù)合體，擔(dān)任著從“源”（如葉片等）到“庫”（如塊根、種子等）運(yùn)輸光合產(chǎn)物的重要作用，而木質(zhì)部中含有大量的薄壁細(xì)胞，起著貯藏淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的作用[14-15]。木薯塊根是由纖維狀須根膨大發(fā)育形成，淀粉主要積累在其膨大的塊根木質(zhì)部中。在塊根膨大過程中，木薯地上部分形成的光合產(chǎn)物，由韌皮部運(yùn)輸?shù)礁?，?jīng)過卸載轉(zhuǎn)運(yùn)及淀粉再合成貯藏在薄壁細(xì)胞中。塊根的韌皮部和木質(zhì)部在此過程起著不同的作用，前者涉及光合產(chǎn)物的卸載和轉(zhuǎn)運(yùn)，而后者則涉及淀粉再合成和貯藏積累。劉斌[16]對木薯塊根蔗糖卸載相關(guān)酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶（CWI）在質(zhì)外體卸載中起著關(guān)鍵作用。在塊根膨大后期，木質(zhì)部CWI活性和表達(dá)量較高，韌皮部則在膨大前期較高，且高淀粉品種CWI蛋白的表達(dá)量整體要高于低淀粉品種。光合產(chǎn)物從“源”到“庫”的運(yùn)輸和貯藏是一個復(fù)雜的、協(xié)調(diào)的系統(tǒng)，對于木薯根部同化物如何卸載轉(zhuǎn)運(yùn)、淀粉高效積累貯藏以及整個生物學(xué)過程涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，目前還不是很清楚。本研究以華南8號（SC8）木薯膨大期塊根韌皮部及木質(zhì)部為材料，采用改進(jìn)酚抽法盡量減少塊根中多糖類和其他雜質(zhì)成分的干擾，以便提取到高質(zhì)量蛋白，系統(tǒng)建立木薯塊根韌皮部及木質(zhì)部蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系，為進(jìn)一步通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法揭示木薯塊根發(fā)育和淀粉積累的調(diào)控機(jī)制提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 SC8木薯種莖由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。當(dāng)年3月中旬扦插種植，正常生長5個月左右，選取生長健壯植株，采集粗壯的木薯塊根，清洗干凈后切取塊根中間段，剝離塊根韌皮部和木質(zhì)部（圖1，A～D），液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 BPP法蛋白提取緩沖液：100 mmol/L Tris， 100 mmol/L EDTA， 50 mmol/L硼砂， 50 mmol/L 維生素C， 1% PVPP（W/V）， 1% Triton X-100（V/V），2% β-巰基乙醇（V/V）和30%蔗糖（W/V）， pH 8.0；蛋白裂解液： 7 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脲， 2% CHAPS（W/V）， 13 mmol/L DTT， 1% IPG buffer（V/V）；標(biāo)準(zhǔn)Laemmli buffer：62.5 mmol/L Tris-HCl ，2% SDS（W/V）， 10% 甘油， 5 % -巰基乙醇（V/V）， 0.001% 溴酚藍(lán)（W/V）；膠條平衡液： 50 mmol/L Tris-HCl， 6 mol/L尿素， 30% 甘油（V/V）， 2% SDS（W/V），0.002%溴酚藍(lán)（W/V）； GAP凝膠染色液： 0.125%考馬斯亮藍(lán)G-250（W/V）， 10% 硫酸銨（W/V）， 5%磷酸（V/V）， 30%（V/V）乙醇 ， 10% 甲醇（V/V）； 凝膠脫色液： 30%乙醇（V/V）， 5%乙酸（V/V）； 酶緩沖液： 1 mmol/L 氯化鈣， 25 mmol/L 碳酸氫銨， pH 8.5。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取 基于酚抽法[17]改進(jìn)的BPP法，具體參考Wang等[18]操作步驟。

1.2.2 蛋白定量 采用Bradford方法[19]，每個樣品至少重復(fù)3次。

1.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳 使用不連續(xù)膠SDS-PAGE法[20]，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12.5%，每孔上樣量約為30 μg，與Laemmli buffer等體積混勻后上樣。電泳條件為16 ℃恒溫電泳3 h左右，參數(shù)設(shè)置為3 W/gel 50 min，6 W/gel 2 h。

二維凝膠電泳（2-DE）：2-DE蛋白上樣量約為1 000 μg，上樣總體積為455 μL。蛋白樣品在水化盤內(nèi)使24 cm的pH 4-7線性IPG干膠條被動吸脹，水化16 h左右。等電聚焦程序設(shè)定為：250 V，3 h；500 V，2 h；1 000 V，1 h； 10 000 V，3 h；10 000 V，130 000 Vhr。聚焦結(jié)束后，用含1% DTT的平衡液和含4%碘乙酰胺的平衡液各平衡膠條15 min，平衡結(jié)束后在Ettan Daltsix電泳儀（GE Healthcare）中進(jìn)行第二向SDS- PAGE，16 ℃恒溫電泳4.5 h左右，電泳參數(shù)設(shè)置為1.5 W/gel 1 h，8 W/gel 3.5 h。

1.2.4 凝膠染色及圖像采集分析 凝膠染色采用改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)染色法[21]。染色后的凝膠用ImageScanner Ⅲ掃描儀（GE Healthcare）進(jìn)行掃描和圖像采集。用ImageMaster 2D Platinum軟件（GE Healthcare）進(jìn)行蛋白點(diǎn)檢測、凝膠匹配、將各個蛋白點(diǎn)的表達(dá)量歸一化后進(jìn)行比較分析，獲得差異表達(dá)蛋白。

1.2.5 蛋白點(diǎn)膠內(nèi)酶解 選取目標(biāo)差異蛋白，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，具體參考簡化膠內(nèi)酶解方法[22]。對挖取的蛋白點(diǎn)，酶解后收集上清液直接用于質(zhì)譜鑒定。

1.2.6 酶解產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫搜索 酶解產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定采用Bruker公司的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS/MS Ⅱ，Bruker），主要操作參考Shen等[23]的方法進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)通過Mascot Distiller軟件分析，分析結(jié)果（即肽指紋圖譜PMF）利用Matrix science網(wǎng)站（http：//www.matrixscience.com）進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索和匹配。檢索條件為：數(shù)據(jù)庫（為NCBInr分類（Taxonomy）選擇綠色植物界，酶類型選擇胰蛋白酶，允許一個位點(diǎn)漏切， 固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M），肽段偏差為±300 ppm。軟件設(shè)定檢索得分閾值為72分，超過72分即認(rèn)為匹配達(dá)到>95%的可信度（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯塊根韌皮部及木質(zhì)部總蛋白的1-DE及2-DE

采用BPP法從每克木薯塊根韌皮部和木質(zhì)部鮮重材料中可以提取得到（0.522±0.132）mg和（0.408±0.045）mg總蛋白（圖2-A），說明木薯塊根中蛋白含量很低，且韌皮部蛋白含量略高于木質(zhì)部。從1-DE結(jié)果（圖2-B）可以看出，蛋白條帶清晰，且分離性較好，沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，在高分子量區(qū)域（>100 ku）和低分子量區(qū)域（<20 ku）都可以檢測到明顯的蛋白條帶。另外，從塊根韌皮部和木質(zhì)部的1-DE圖譜中分別可以檢測到（49±2）和（46±1）條蛋白帶，而且2種組織的蛋白條帶圖譜很相似，個別條帶在豐度上出現(xiàn)差異（圖2-B 箭頭所指）。

從2-DE圖譜（圖3-A、B）上看，不管是塊根韌皮部還是木質(zhì)部，其凝膠背景都很干凈，蛋白點(diǎn)呈圓形或橢圓形，邊界清晰，基本無拖尾現(xiàn)象。應(yīng)用ImageMaster軟件對這2種組織蛋白的2-DE圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果從韌皮部中檢測出（1 068±49）個蛋白點(diǎn)，從木質(zhì)部中檢測出（982±31）個蛋白點(diǎn)（圖3-C），韌皮部分離的蛋白點(diǎn)數(shù)比木質(zhì)部稍多，說明韌皮部中可能含有種類更為豐富的蛋白。對2-DE圖譜中的蛋白點(diǎn)的分布區(qū)域進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，2種組織的蛋白在不同pH值范圍分布相對較為均勻，而在pH 5～6范圍內(nèi)稍多（圖3-D）。2種組織的蛋白分子量主要集中在20～100 ku，低于20 ku和高于100 ku蛋白相對較少，在低于20 ku區(qū)域一些高豐度蛋白較多，尤其是在塊根木質(zhì)部中，高豐度蛋白分子量多集中在20 ku左右，而高于100 ku區(qū)域含有較多的低豐度蛋白（圖3-E）。

2.2 塊根韌皮部及木質(zhì)部蛋白質(zhì)組差異分析

為了研究木薯塊根2個不同組織部位蛋白表達(dá)模式的差異，利用ImageMaster軟件對同一發(fā)育時(shí)期塊根韌皮部和木質(zhì)部2-DE圖譜進(jìn)行比較分析，找到了265個差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)（表達(dá)豐度變化1.5倍以上），包括46個組織特異性蛋白點(diǎn)及219個豐度差異蛋白點(diǎn)（圖4-A、B），在韌皮部發(fā)現(xiàn)了29個特異蛋白點(diǎn)（圖4-A），119個相對于木質(zhì)部表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)，在木質(zhì)部發(fā)現(xiàn)17個特異蛋白點(diǎn)（圖4-B），100個相對于韌皮部表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)。這些差異蛋白點(diǎn)有可能與韌皮部和木質(zhì)部的不同代謝調(diào)控生理活動相關(guān)。因此，鑒定出這些差異蛋白信息將對于理解木薯塊根同化物轉(zhuǎn)運(yùn)和淀粉積累調(diào)控機(jī)制具有十分重要的參考價(jià)值。

2.3 差異蛋白點(diǎn)膠內(nèi)酶解及MALDI-TOF-MS分析

在木薯塊根韌皮部和木質(zhì)部2-DE凝膠上各選取7個重復(fù)性好且分離性好的代表性差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，隨后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，獲得PMF圖譜（圖5-A）。從所得的PMF圖譜上看（圖5-A），主要肽段峰集中在800～2 500（m/z）之間，這樣的酶切片段更加有利于后續(xù)的數(shù)據(jù)庫搜索以及進(jìn)一步的二級質(zhì)譜分析。肽段主峰的信噪比較高，角蛋白峰（1 475.754）較少且信號較低，說明肽段抽提產(chǎn)物中含雜質(zhì)較少，無角蛋白污染。大多數(shù)蛋白的總肽段數(shù)在30～50左右，最高可達(dá)118條（表1），而且典型的胰蛋白酶自切峰（2 163.071）強(qiáng)度也較低，說明該方法中酶切效率也較高，自切程度低。由于熱帶作物木薯沒有專用蛋白數(shù)據(jù)庫，因此將質(zhì)譜結(jié)果通過Mascot Distiller軟件分析后，利用Matrix Science搜索引擎（http：//www.matrixscience.com/search）在NCBInr綠色植物總庫中進(jìn)行搜索，最終有8個蛋白點(diǎn)的一級質(zhì)譜搜庫得分值超過了72分可信值（p<0.05），鑒定成功率在60%左右。

2.4 鑒定蛋白的生物信息學(xué)分析

在鑒定出的8個蛋白點(diǎn)中，有2個為組織特異性蛋白（Spot C1，Spot C8），其余蛋白點(diǎn)為組織表達(dá)差異蛋白。對搜庫得到的可信蛋白理論等電點(diǎn)和分子量與實(shí)驗(yàn)測得等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)值和理論值基本一致，在雷達(dá)示意圖中比值都集中在1附近（圖5-B）。只有個別蛋白的等電點(diǎn)和分子量出現(xiàn)偏差，例如Spot C1，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白是某些蛋白的亞基，而執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白通常是由多亞基組成，在進(jìn)行變性膠電泳時(shí)可以將其各個亞基分離。因此，等電點(diǎn)和分子量會出現(xiàn)偏移現(xiàn)象。另外一些鑒定蛋白，如Spot C5，是葡萄物種的推測蛋白，將其氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，與其同源性較高的大多數(shù)蛋白基本都是18 ku熱激蛋白（18.2 ku class I heat shock protein）家族成員，從而確定該蛋白也屬于這一家族?？梢园l(fā)現(xiàn)，木薯塊根中尤其是木質(zhì)部中18 ku熱激蛋白表達(dá)量非常高（表1；圖4），這可能與木薯的優(yōu)良耐干旱特性密切相關(guān)。

同時(shí)，利用NCBI中的COG數(shù)據(jù)庫對已鑒定蛋白進(jìn)行功能分類分析，發(fā)現(xiàn)蛋白功能可歸于5類：1）翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)或分子伴侶相關(guān)（O）， 有3個蛋白， 分別是C1，C5，C6； 2）無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（P），有2個蛋白，分別是C2，C4；3）轉(zhuǎn)譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源，有1個蛋白；4）氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，有1個蛋白；5）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，有1個蛋白（表1；圖5-C）。

3 討論與結(jié)論

3.1 木薯塊根韌皮部和木質(zhì)部蛋白提取及雙向電泳方法的確定

植物蛋白提取技術(shù)一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)，蛋白提取質(zhì)量的好壞會直接影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性。不同的植物組織結(jié)構(gòu)及成分不同，適用的蛋白提取方法也不盡相同。木薯塊根尤其是木質(zhì)部中含有大量的淀粉及可溶性糖，而韌皮部中含有大量纖維成分，傳統(tǒng)的蛋白提取方法（如TCA/丙酮沉淀法[24-25]）通常難以高效去除這些物質(zhì)獲得高純度蛋白，而且繁瑣的提取過程會增加蛋白損失率。酚抽法[26-27]可以選擇性將蛋白分離至酚相中，多糖、多酚及鹽分可以保留在水相中，得到純度較高的蛋白產(chǎn)物。采用BPP法優(yōu)化改進(jìn)了傳統(tǒng)酚抽法，其蛋白提取液中含有強(qiáng)除雜能力的試劑硼砂（Borax）和聚乙稀聚吡咯烷酮（PVPP），較高濃度的β-巰基乙醇和維生素C可以降低蛋白酶活性從而避免蛋白降解。本研究采用BPP蛋白提取方法，制備出適合雙向電泳的質(zhì)量較高的蛋白樣品。除了蛋白提取質(zhì)量的好壞會影響2-DE結(jié)果外，水化上樣、等電聚焦、膠條平衡、二向SDS-PAGE電泳及凝膠染色等技術(shù)環(huán)節(jié)也會對結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。等電聚焦是否充分直接影響到蛋白一向分離效果，聚焦不足蛋白不能有效分離會導(dǎo)致橫向拖尾，聚焦過度同樣會出現(xiàn)橫向拖尾現(xiàn)象且易丟失低豐度點(diǎn)。在進(jìn)行木薯葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白上樣量在1～1.5 mg范圍時(shí)，10 000 V電壓聚焦至130 000 Vh可以獲得較好的聚焦效果，得到較多的蛋白點(diǎn)[28]。因而將該聚焦條件應(yīng)用到木薯塊根時(shí)，同樣獲得不錯的分離效果。同時(shí)考慮后續(xù)質(zhì)譜分析，采用具有高靈敏度和質(zhì)譜兼容性的改進(jìn)考馬斯亮藍(lán)染色法[21]，獲得背景干凈，蛋白點(diǎn)圓形或橢圓形的木薯塊根2-DE圖譜。

3.2 鑒定蛋白的功能分析

所鑒定蛋白涉及到蛋白翻譯后修飾，無機(jī)離子和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，分子伴侶以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能，可能與同化物在韌皮部卸載轉(zhuǎn)運(yùn)，信號感受和遠(yuǎn)距離傳遞，糖代謝相關(guān)酶活性調(diào)控以及淀粉積累等生物學(xué)過程密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)已鑒定的8個蛋白中有2個是組織特異表達(dá)的，其中Spot C1鑒定為26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基，在韌皮部中特異表達(dá)，而Spot C8為蛋白激酶，在木質(zhì)部中特異表達(dá)，前者與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)相關(guān)，而后者與蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)，功能分類上與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。

抗壞血酸氧化酶（Spot C2）、MnSOD（Spot C4）和過氧化還原酶（Spot C6）都是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。植物即使在最佳的生長條件下也能通過新陳代謝途徑產(chǎn)生活性氧比如電子傳遞等途徑，過多的活性氧會使植物產(chǎn)生氧化損傷，而抗壞血酸氧化酶、MnSOD和過氧化還原酶能夠有效消除活性氧的產(chǎn)生，是阻止氧化脅迫的重要組分[29]。本研究中，抗壞血酸氧化酶、MnSOD和過氧化還原酶在木質(zhì)部中大量上調(diào)表達(dá)，可能是木質(zhì)部中淀粉形成和貯藏過程會消耗大量的能量，由于能量消耗和無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中產(chǎn)生許多活性氧，而抗壞血酸氧化酶、MnSOD和過氧化還原酶大量表達(dá)就是為了消除活性氧的產(chǎn)生，避免對木薯塊根木質(zhì)部在淀粉積累過程中產(chǎn)生氧化脅迫，而使細(xì)胞內(nèi)氧化還原內(nèi)環(huán)境受到破壞，從而影響細(xì)胞的正常代謝和植物正常的生長發(fā)育過程。因此，初步推斷木薯塊根淀粉積累的過程中能夠促進(jìn)抗氧化蛋白的表達(dá)。

翻譯起始因子5A（Spot C3）是調(diào)控生物生長發(fā)育、衰老及環(huán)境適應(yīng)等的重要因子，有研究表明它是調(diào)控細(xì)胞增殖生長和衰老的重要分子開關(guān)[30]。對正在衰老的番茄花、子葉、果實(shí)和成熟的鳳梨果實(shí)的研究發(fā)現(xiàn)eIF5A的大量表達(dá)，證實(shí)eIF5A與植物細(xì)胞衰老關(guān)系密切[30，31]。本研究中，翻譯起始因子5A在木薯塊根木質(zhì)部中大量上調(diào)表達(dá)，可能與本試驗(yàn)取材是成熟的木薯塊根相關(guān)，淀粉在木薯塊根木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中大量積累，但同時(shí)有許多細(xì)胞不斷的衰老死亡，以此促進(jìn)了翻譯起始因子5A的表達(dá)。

谷氨酰胺合成酶（Spot C7）是一種控制氮代謝的酶，能夠吸收無機(jī)氮轉(zhuǎn)換為有機(jī)氮，能夠催化銨離子和谷氨酸相結(jié)合產(chǎn)生谷氨酸鹽，并伴隨有能量的消耗，而給植物供給營養(yǎng)[32]。研究表明，木薯塊根淀粉含量與谷氨酰胺合成酶是正相關(guān)[33]。本研究所鑒定的谷氨酰胺合成酶在木薯塊根木質(zhì)部的表達(dá)量高于韌皮部，結(jié)合已有的研究初步說明木薯塊根木質(zhì)部淀粉積累過程中，需要大量表達(dá)谷氨酰胺合成酶來調(diào)節(jié)體內(nèi)的氮代謝，促進(jìn)光合產(chǎn)物的運(yùn)輸和淀粉的有效合成及積累。

18 ku熱激蛋白Ⅰ（Spot C5）在木質(zhì)部中相對上調(diào)表達(dá)，已有研究發(fā)現(xiàn)其與植物的水分脅迫應(yīng)答及耐旱特性相關(guān)[34]。該蛋白主要作為分子伴侶執(zhí)行功能，除了與植物水分脅迫應(yīng)答相關(guān)外，小分子熱激蛋白還可以提高植物的耐寒性[35]，為提高木薯的抗寒能力提供了一個新思路。

木薯塊根主要是由于少數(shù)（約3～10條）纖維狀須根的次級生長活動造成[36]，形成層活動分化出大量次生薄壁細(xì)胞，使得根部迅速膨大[37]，與此同時(shí)光合作用產(chǎn)生的大量糖類運(yùn)輸至薄壁細(xì)胞中，以淀粉形式積累貯藏。在此過程中，木薯塊根的韌皮部和木質(zhì)部的蛋白表達(dá)發(fā)生了相應(yīng)變化，從而調(diào)節(jié)淀粉積累過程的有效進(jìn)行。雖本研究結(jié)果為研究木薯塊根淀粉積累調(diào)控提供了一定的線索，但仍有許多差異蛋白未鑒定，這些蛋白中可能也存在著許多有價(jià)值的關(guān)鍵蛋白，需要在今后的研究中進(jìn)一步做功能鑒定分析。

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