曾心怡

長(zhǎng)江大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，湖北 荊州 434023

艾葉系菊科植物艾ArtemisiaargyiLévl.et Vant.的干燥葉，又名灸草，為多年生草本植物，其味辛、苦，性溫，入肝、脾、腎經(jīng)，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛之功效，臨床用于吐血、衄血、崩漏等癥[1]。全國各地所產(chǎn)艾葉中以明代李時(shí)珍故居湖北蘄春所產(chǎn)為佳，當(dāng)?shù)刂^之為“蘄艾”，被視為艾中珍品、道地藥材[2]。當(dāng)前，對(duì)蘄春艾葉的研究與應(yīng)用主要圍繞其揮發(fā)油的提取[3-6]、藥理活性[7-9]及臨床應(yīng)用[10-13]研究，鮮有其總黃酮、有機(jī)酸、多糖等成分及其綜合開發(fā)應(yīng)用研究的報(bào)道。蘄春艾葉作為蘄春當(dāng)?shù)氐奶厣乩順?biāo)志產(chǎn)品[14]，其開發(fā)利用仍集中于揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分粗加工產(chǎn)品以艾條、艾絨、揮發(fā)油等系列產(chǎn)品為主[15]，然而蘄春艾葉的采收期(端午節(jié)前后)過后，隨著揮發(fā)性成分含量急劇下降其藥用價(jià)值難以持續(xù)體現(xiàn)，加之粗加工提取揮發(fā)油后藥液和藥渣含有大量的總黃酮和有機(jī)酸成分[16]，大量遺棄勢(shì)必造成蘄春艾葉資源的浪費(fèi)，故測(cè)定不同生長(zhǎng)期蘄春艾葉總黃酮和綠原酸對(duì)于開發(fā)高附加值產(chǎn)品有積極的促進(jìn)意義?；诖吮狙芯酷槍?duì)不同生長(zhǎng)期蘄春艾葉的總黃酮、綠原酸進(jìn)行分析和比較，為進(jìn)一步綜合開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料

Waters2695型高效液相色譜儀;Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；CP225D電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；UV-8000紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)；KQ-250E超聲波發(fā)生器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；98-1-B電子調(diào)溫加熱套(天津泰斯特儀器有限公司)。

蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-201511，純度>99.90%)；綠原酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201513，純度>99.99%)；乙腈(美國天地公司，色譜純)；其余試劑均為分析純；水為三蒸水。

艾葉分別于2015年5、6、9、10月采自湖北蘄春(樣品編號(hào)分別為150515-S1、150518-S2、150616-S3、150630-S4、150916-S5、150927-S6、151001-S7、151007-S8)。樣本經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源開發(fā)教研室方念伯教授鑒定為菊科植物艾ArtemisiaargyiLévl.et Vant.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同生長(zhǎng)期艾葉藥材中總黃酮含量測(cè)定

2.1.1溶液配制

2.1.1.1對(duì)照品溶液 取蘆丁對(duì)照品適量，經(jīng)120 ℃充分干燥，放冷后精密稱定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇置于水浴中微熱使溶解，定容并搖勻制成5.0 mg·mL-1的溶液作為蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取蘆丁儲(chǔ)備液5 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.1.1.2供試品溶液 分別取各批次艾葉藥材約1.00 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，密塞稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHZ)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.2線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，最后加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，照《中華人民共和國藥典》紫外-可見分光光度法，分別于508 nm處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。得線性回歸方程為：Y=0.011 7X-0.007，r=0.999 7。結(jié)果表明，蘆丁于20.0～100.0 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液3.0 mL，置25 mL量瓶中，按2.1.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起操作，在同一條件下分別測(cè)定吸光度6次，吸光度的RSD為0.13%，結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液2.0 mL，置25 mL量瓶中，按2.1.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起操作，分別在0、10、20、40、60 min后測(cè)定吸光度，RSD為0.14%，結(jié)果表明，供試品溶液穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取供試品6份，每份1.0 g，精密稱定，照2.1.1.2項(xiàng)下的方法依法制備，精密吸取各供試品溶液2.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，按2.1.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起操作，在同一條件下分別測(cè)定吸光度，將吸光度值代入回歸方程中計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果總黃酮含量RSD為1.89%。

2.1.4加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批供試品(批號(hào)：150515-S1)6份，每份100 mg，精密稱定，分別加入一定量的蘆丁對(duì)照品，照2.1.1.2項(xiàng)下的方法依法制備，精密吸取各供試品溶液2.0 mL，置5個(gè)25 mL量瓶中，按2.1.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起操作，依法測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該方法加樣回收率良好。

表1 艾葉中蘆丁加樣回收試率驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.5測(cè)定法 精密吸取供試品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至6 mL，照2.1.2項(xiàng)下的方法，自“加5%亞硝酸鈉溶液1 mL”起，依法測(cè)定吸光度，同時(shí)取供試品溶液1 mL，除不加蘆丁對(duì)照品溶液外，其余同上操作作為空白，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液中含蘆丁的質(zhì)量，即得。

隨著肥胖婦女的不斷增多，肥胖孕婦的比例也在不斷增加，孕前體質(zhì)量及孕期增重對(duì)妊娠結(jié)局的影響受到越來越多的關(guān)注。有研究[7-8]表明，過高、過低的孕前BMI水平及妊娠體質(zhì)量增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致新生兒體質(zhì)量異常。所以，孕期應(yīng)有效控制肥胖孕婦體質(zhì)量增長(zhǎng)。

2.1.6結(jié)果 按上述測(cè)定方法，對(duì)不同生長(zhǎng)期蘄春艾葉藥材中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 不同采收期艾葉總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

2.2 不同生長(zhǎng)期艾葉藥材中綠原酸含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈為(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～13 min，10%～20%A；13～20 min，20%～45%A；20～25 min，45%～10%A)，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm，流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以綠原酸色譜峰計(jì)不低于4000。

2.2.2溶液配制

2.2.2.1對(duì)照品溶液 取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.06 mg的溶液，即得。

2.2.2.2供試品溶液 參照文獻(xiàn)[16]，取艾葉藥材適量、剪碎，精密稱取2 g置于具塞錐形瓶中，精密加50%的甲醇溶液50 mL，密塞稱定其質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)2 h，取出放冷至室溫，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，移取濾液10 mL于25 ml容量瓶中，以50%甲醇溶液定容，搖勻，微孔濾膜濾過即得供試品。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 各取上述供試品、對(duì)照品和空白溶劑，分別按照2.2.1項(xiàng)下進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，該分析條件下綠原酸與相鄰的峰分離度良好，且樣品中其他組分對(duì)綠原酸的分離無干擾。

注：A.艾葉供試品；B.綠原酸對(duì)照品；C.空白溶液。圖1 綠原酸對(duì)照品和艾葉HPLC圖

2.2.4線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、10、12、15 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以綠原酸對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程：Y= 27.274X+0.348，r= 0.999 7。結(jié)果表明：綠原酸在0.12～0.90 μg進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液(批號(hào)：20150515)按上述色譜條件，分別在0、4、8、12、24 h記錄其峰面積，峰面積 RSD為0.57%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批供試樣品6份，每份約2 g，精密稱定，按2.2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算綠原酸含量，RSD為1.18%，表明重復(fù)性良好。

2.2.6加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批艾葉6份，每份2 g，精密稱定，加入一定量的綠原酸對(duì)照品，按2.2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率結(jié)果見表3。

表3 艾葉中綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

取各批次的艾葉藥材按2.2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備依法制備各供試品，按上述測(cè)定方法，對(duì)不同生長(zhǎng)期蘄春艾葉綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 不同采收期艾葉中綠原酸含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

3.1 艾葉藥材中總黃酮含量測(cè)定

研究中曾參考文獻(xiàn)[16]以柚皮苷作為對(duì)照品，不加顯色劑于283 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照品柚皮苷顯色后呈淡黃色，而制備的供試品溶液顏色較深，測(cè)定存在一定程度的背景干擾，空白試劑無法有效消除樣品的背景干擾；而研究發(fā)現(xiàn)采用亞硝酸鈉顯色法能夠較好地消除背景干擾，故最終采用亞硝酸鈉顯色法測(cè)定其總黃酮含量。結(jié)果表明，5月、6月和9月艾葉中總黃酮含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。9月末隨著艾葉植株逐漸老化，總黃酮呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)，10月后艾葉藥材總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降至1.36 mg·g-1，含量較9月末前下降了約80%。這一研究結(jié)果提示，在艾葉藥材的次生代謝產(chǎn)物中，總黃酮對(duì)季節(jié)的變化敏感度相對(duì)較低，僅在10月艾葉植株老化之后，艾葉營養(yǎng)分散，次生代謝產(chǎn)物合成速率減慢，總黃酮含量急劇減少。

3.2 艾葉藥材中綠原酸含量測(cè)定

研究最初采用文獻(xiàn)[16]的梯度洗脫程序?qū)G原酸含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)60 min，不能較好地滿足含量測(cè)定的時(shí)限要求，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化并縮短梯度洗脫時(shí)間，保證綠原酸分離度達(dá)到要求，建立的方法更加快捷、迅速。結(jié)果表明，5月、6月和9月艾葉中綠原酸含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同生長(zhǎng)期艾葉中綠原酸的含量由高到低依次為：6月、9月、5月、10月。6月艾葉中綠原酸含量較高，10月艾葉綠原酸含量較低，10月份綠原酸含量較9月份前降低了約78%。傳統(tǒng)認(rèn)為艾葉采收期夏季未開花時(shí)(端午前后)，此時(shí)揮發(fā)性成分含量最高，綠原酸的含量也呈現(xiàn)出最高水平。盡管已有大量研究報(bào)道指出艾葉熏洗液有較強(qiáng)的抑菌效果，但其抑菌效果是否源自于艾葉揮發(fā)性成分和其中的總黃酮、綠原酸類成分的共同作用還值得進(jìn)一步考證。

4 結(jié)論

從不同生長(zhǎng)期艾葉總黃酮和綠原酸的分析結(jié)果可知：全年中5月、6月和9月時(shí)艾葉中總黃酮含量和綠原酸含量總體上變化程度不大，總黃酮和綠原酸對(duì)季節(jié)變化的敏感程度較低且兩者含量變化呈一定程度的正相關(guān)，即總黃酮含量降低時(shí)綠原酸含量也隨之降低。《中華人民共和國藥典》中對(duì)艾葉的采收期規(guī)定為夏季未開花時(shí)(端午前后)采收，而此時(shí)艾葉的揮發(fā)性成分藥用價(jià)值難以體現(xiàn)，是為艾葉藥用資源的浪費(fèi)。本研究結(jié)果為采收期后至10月前這段時(shí)期蘄春艾葉的綜合利用與合理開發(fā)提供參考依據(jù)。