李響明，孫勝斌，姜國志

1.河北省中藥注射液工程技術研究中心，河北 石家莊 051430; 2.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430; 3.中藥注射劑新藥技術開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北 石家莊 051430

燈盞花素收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部[1]402-403植物油脂和提取物項下，由菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.中提取分離所得，其主要有效成分為野黃芩苷(C21H18O12)。燈盞花素具有廣泛、確切的藥理活性，如抗組織缺血再灌注損傷、抗血栓、增加血流量、改善微循環(huán)、擴張血管、降低血黏度、調節(jié)血脂、抗氧化等[2-3]。作為臨床治療心血管類疾病的常用藥，以燈盞花素為原料的制劑中口服和靜脈注射液是當前制劑研究的主流[4]，其中注射劑產品包括燈盞花素注射液、注射用燈盞花素、燈盞花素氯化鈉注射液、燈盞花素葡萄糖注射液，前兩者的臨床應用較廣。

燈盞花素注射液、注射用燈盞花素均以燈盞花素為原料，添加適宜輔料，應用現(xiàn)代制劑技術分別制成了注射用濃溶液、注射用無菌粉末，兩者均有活血化瘀、通絡止痛的功效。用于中風及其后遺癥、冠心病、心絞痛[5]。燈盞花素注射液執(zhí)行《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第二十冊(WS3-B-3822-98)[6]102，注射用燈盞花素現(xiàn)行質量標準為《中華人民共和國藥典》2015年版一部[1]1110-1111，2個質量標準差異較大。本文對比分析了以上2個產品質量標準的不同點，并整理了近20年來上述2個產品的質量控制研究文獻，為規(guī)范和提高產品的質量標準提供參考。

1 現(xiàn)行質量標準對比分析

2個產品的現(xiàn)行質量標準差異較大，鑒別、檢查、含量測定均有不同。下面將2個產品的質量標準進行對比分析，見表1。

表1 燈盞花素注射液與注射用燈盞花素質量標準對比

1.1 鑒別

鑒別是根據(jù)制劑的理化特性制定的用于鑒別藥品真?zhèn)蔚姆椒?，因此要求方法專屬性強。水針劑鑒別共3項：1)采用了黃酮類化合物經(jīng)典的鹽酸-鎂粉還原顯色反應，該鑒別專屬性不夠強；2)使用紫外分光光度法確認黃酮類成分苯甲?；?284 nm附近)和桂皮?；?335 nm附近)的最大吸收波長，標準要求的最大吸收波長為固定值，未兼顧不同設備廠家、型號的分析儀器間吸收波長稍有波動的可能性；3)利用黃酮類化合物在365 nm下的熒光特性進行薄層色譜鑒別，該鑒別中使用的燈盞花素對照品在多個標準物質目錄中查詢均無此標準物質，有人認為燈盞花素即為燈盞花乙素(野黃芩苷)，該處表述有待進一步規(guī)范。粉針劑鑒別照“含量測定”項下的方法實驗，在含量測定的同時完成鑒別，方法方便、準確，節(jié)約對照品。

1.2 檢查

檢查項目的設定與制劑的劑型和臨床使用途徑有關，除了對制劑中雜質、有關物質的質量控制外，pH/酸堿度、溶液的澄清度、不溶性微粒、熱原與無菌等安全性項目的檢查為臨床的安全使用提供了基礎性的保障，全面的質量檢測是產品上市前質量控制的一個重要環(huán)節(jié)。水針劑質量標準已實施二十多年，粉針劑現(xiàn)行質量標準自2015年生效，整體來看，粉針劑質量標準的要求相對更高，這可能與標準建立時制劑的分析技術水平有關。粉針劑產品質量標準在安全性方面更嚴格，過敏試驗、降壓物質、異常毒性、溶血與凝聚的檢測保證了上市產品的質量。2個產品均有的項目，也略有不同，比如有關物質(蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子)和熱原。粉針劑檢查時溶液中含燈盞花素(野黃芩苷)的濃度更大，其中有關物質檢查時粉針劑濃度約是水針劑最大濃度的2.5倍，粉針劑熱原檢查家兔注射的劑量是水針劑的1.6倍。

關于燈盞花素原料相關物質的研究中，已有文獻明確含有6-羥基山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸、燈盞花甲素、野黃芩素和芹菜素4個相關物質[7-8]；也有研究從注射用燈盞花素原料中分離鑒定出6-羥基芹菜素-6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷、5，7，8，3′，4′，5′-六羥基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷、5，6，7，3′，4′-五羥基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷及其異構體、patuletin-3-O-葡萄糖醛酸苷、甲氧基燈盞乙素、燈盞甲素、異鼠李素-7-O-葡萄糖醛酸苷、香葉木素-7-O-葡萄糖醛酸苷、野黃芩素、燈盞乙素甲酯、燈盞乙素乙酯、芹菜素13個雜質[9]。因此為了保證臨床用藥安全，進行相關物質的質量控制顯的很有必要。2個產品有關物質/相關物質的檢查均使用高效液相色譜法(HPLC)，除檢測波長相同外，流動相、供試品溶液和對照品溶液的濃度、計算方法均不同。主成分自身對照法是目前《中華人民共和國藥典》等有關物質檢查的常用方法。已有文獻指出在燈盞花素注射液有關物質的色譜條件下主峰峰形拖尾[10]。

1.3 含量測定

含量測定是對目前制劑中已知的活性物質、代表性化合物或大類成分的控制，與原料的物質基礎、制劑的生產工藝緊密相關，是保證臨床治療效果的前提。燈盞花素為黃酮類化合物，注射用濃溶液利用其紫外吸收的特性，采用紫外-可見分光度法檢測，且利用百分吸收系數(shù)計算，省去了對照品的使用，降低了檢測成本。但也有文獻指出該方法專屬性不強，測定的是總黃酮類化合物[11-14]。粉針劑含量測定使用以野黃芩苷為對照品的高效液相色譜法，且色譜條件與相關物質檢查的條件一致，使得分析工作變得簡便、高效。2個標準的限度均采用百分標示量，水針劑含量的限度范圍明顯窄于粉針劑的范圍。

燈盞花素注射液、注射用燈盞花素均以燈盞花素為原料制成的注射劑，兩者的現(xiàn)行質量標準存在差距，注射用燈盞花素質量控制相對更嚴格。其中燈盞花素注射液質量標準有待進一步規(guī)范，適當增加部分安全性方面的檢查項目并優(yōu)化有關物質、含量測定的方法，提高質量控制水平。

2 質控研究進展

在《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第二十冊中燈盞花素注射液、注射用燈盞花素[6]174質量標準除因制劑存在狀態(tài)不同，而某些檢查項目不同外，大多數(shù)項目的質量控制方法類似。注射用燈盞花素在《中華人民共和國藥典》2005年版、2009年增補本[15]中有了明顯提高，在2010年版[16]848-849中僅修訂了熱原檢查項注射的溶液濃度，在2015年版[1]1110-1111中未做修訂。筆者查閱了近20年的文獻，發(fā)現(xiàn)關于燈盞花素注射液的質量研究較多，涉及含量測定、有關物質、指紋圖譜、安全性項目等，還有少量關于注射用燈盞花素中輔料測定的研究等，以下將分別綜述。

2.1 鑒別

燈盞花素注射液鑒別(2)中，本品用甲醇稀釋后，要求在284 nm及335 nm處應有最大吸收。有文獻[17]指出，不同廠家、不同等級乙醇對紫外鑒別的結果有影響，主要是甲醇溶劑中的雜質干擾了供試品的吸收，提示在測定時要使用無干擾的甲醇。

2.2 有關物質/相關物質

雖燈盞花素原料純度已經(jīng)很高，但仍有約2.0%的雜質類物質，為了保證臨床用藥安全，開展相關物質的研究很有必要。鄭金鳳等[10]建立了HPLC測定燈盞花素注射液中有關物質的方法，以甲醇-0.1 mol·L-1醋酸銨溶液(用磷酸調節(jié)pH 3.0)(32∶68)為流動相，335 nm波長，柱溫 30 ℃下測定，主峰和雜質峰完全分離，收集的10批樣品中除溶劑峰外，各雜質峰峰面積之和占主峰峰面積3.53%～29.19%，這一結果與使用現(xiàn)行質量標準6[102]中有關物質檢測方法所得結果相比，明顯要高。申穎等[18]使用HPLC，以甲醇-水-冰醋酸(30∶70∶1)為流動相，335 nm下測定了不同廠家的3批注射用燈盞花素有關物質，按歸一法計算后樣品溶液除主成分峰及首峰以外的其他峰面積之和占總峰面積(除首峰外)的0.69%～0.78%。代勇等[14]采用HPLC建立了燈盞花素注射液有關物質的檢查方法，以甲醇-0.1 mol·L-1醋酸銨(45∶55)(磷酸調節(jié)pH 2.4)為流動相，在335 nm下檢測，記錄圖譜至主成分峰保留時間的2.5倍，主成分自身溶液對照法計算，收集的3批樣品各雜質峰面積總和占對照溶液主峰面積7.8%～8.1%。

2.3 特征圖譜

中藥注射劑指紋圖譜技術可以全面反映所含的化學成分，圖譜的差別不僅能反映主要成分的差異，還能反映出一些含量較低甚至微量成分的差異，是全面評價產品質量的一種手段。相關研究[19-20]建立了以甲醇-0.4%磷酸緩沖液梯度洗脫，335 nm波長下測定燈盞花素注射液指紋圖譜的方法，選定了7個共有峰，10批不同廠家的產品相似度為0.754～0.913，差別明顯。耿家玲等[21]使用0.5%甲酸溶液-甲醇-乙腈為流動相梯度洗脫，檢測波長330 nm,測定了13個廠家89批燈盞花素注射液的特征圖譜和野黃芩苷含量，特征圖譜相似度差距顯著，野黃芩苷含量參差不齊，含量也是造成指紋圖譜相似度低的主要原因。馮子男等[22]使用甲醇-0.1%磷酸溶液(40∶60)等度洗脫，在335 nm下測定了10批市售燈盞花素注射液的指紋圖譜，不同廠家的指紋圖譜相似度有明顯差異，可能與不同廠家生產工藝的不同關系更大。

2.4 含量測定

現(xiàn)在研究中主要以HPLC測定燈盞花素注射液中燈盞花乙素(野黃芩苷)含量，專屬性強，測定結果準確。林泳月等[23]建立了紫外法測定燈盞花素注射液含量的方法，以燈盞花乙素為對照品制備標準曲線，測定供試品溶液吸光度后從標準曲線中計算出含量。趙梅等[11]以甲醇-0.05%磷酸溶液(13∶87)為流動相，在335 nm下測得野黃芩苷含量,比紫外法測得結果稍低。張世軒等[12]以黃芩苷為內標加校正因子法測定燈盞花素注射液中野黃芩苷含量，并測定了5批樣品的含量，結果均低于紫外法測得結果，與紫外測定法專屬性不強的說法一致。雷灼雨[13]以甲醇-水-冰醋酸(30∶70∶1)為流動相測定了4個廠家6批燈盞花素注射液，含量為標示量的97.8%～100.2%，結果準確。彭金香等[24]建立了以甲醇-水(60∶40)為流動相測定燈盞花素注射液含量的方法，操作方便，可作為該產品含量控制的方法。還有研究者建立了燈盞花素注射液野黃芩苷含量和相關物質在同一色譜條件下測定的方法[10，14]，使得分析工作變更簡便、高效，可作為生產企業(yè)質量控制的方法。

燈盞花素中黃酮類化合物為主要活性成分，因此總黃酮含量也有必要控制?？傸S酮含量測定多選擇蘆丁為對照品，使用紫外-可見分光光度法測定。方崇波[25]建立了以野黃芩苷為對照，采取離子絡合方法測定注射用燈盞花素總黃酮含量的方法，測定的6批產品總黃酮含量為標示量的100.1%～105.1%。

2.5 輔料

注射劑在生產中，往往會根據(jù)藥物的性狀，適當?shù)靥砑右欢ㄝo料來調節(jié)主藥的溶解度、穩(wěn)定性、酸堿性等。注射劑是一種直接注射進入血液循環(huán)系統(tǒng)的劑型，對其質量要求更高，安全性更好。輔料也是注射劑的一個重要組成部分，其質量與制劑的質量直接相關，因此也很有必要控制輔料的質量，目前文獻中對輔料的研究有精氨酸和甘露醇。王先然等[26]建立了HPLC測定注射用燈盞花素中精氨酸含量測定的方法，以50 mmol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(95∶5)為流動相，波長206 nm下檢測，方法專屬性好、準確，測定了4批注射用燈盞花素，精氨酸平均含量為11.79 mg。李金蘭[27]使用不同的方法分別測定了注射用燈盞花素中甘露醇含量，參考《中華人民共和國藥典》2010年版甘露醇[16]87含量測定的碘量法，測定了注射用燈盞花素中甘露醇含量，操作簡單、結果準確，但滴定需在碘量瓶中進行，避免碘蒸發(fā)影響結果；建立了紫外分光光度法測定甘露醇含量，以甘露醇為對照品，與試劑反應顯色后在412 nm波長處測定，實驗操作相對簡單，顯色反應受外界pH、溫度、光照等影響；還建立了使用氨基柱、蒸發(fā)光檢測器，以乙腈-水(83∶17)為流動相測定甘露醇含量的高效液相色譜法，該方法專屬性高、結果準確；上述3種測定方法相比，HPLC優(yōu)于另外2種，可作為注射用燈盞花素中甘露醇含量測定的方法。

2.6 其他

郭紅麗等[28]建立了注射用燈盞花素中13種金屬元素的測定方法，HNO3和H2O2作為消解體系，采用微波消解法前處理樣品后，以Sc、In、Rh、Re作為內標測定Pb、Cd、Hg、As、Cu、Fe、Mn、Ba、Zn、Al、Co、Cr、Ni 13種金屬元素的含量，方法準確、靈敏度高，可作為該中藥注射液質量監(jiān)控的方法。

2.7 安全性研究

細菌內毒素：目前燈盞花素注射液使用家兔法檢查熱原，具有成本高、時間長、影響因素多、靈敏度低的缺點，目前有研究使用鱟試劑檢查細菌內毒素以代替熱原的檢查。燈盞花素注射液細菌內毒素的檢查，凝膠法和動態(tài)比濁法在文獻中都有報道。中藥注射劑由于成分復雜和工藝的特殊性，往往對細菌內毒素檢查有干擾。高濃度燈盞花素可抑制細菌內毒素與鱟試劑的凝膠形成，通常采用稀釋若干倍數(shù)的方法，排除干擾。同樣使用膠凝法，不同文獻中稀釋倍數(shù)也不盡相同[29-34]，這除了與鱟試劑靈敏度、產品規(guī)格有關外，還可能與不同廠家生產工藝不同有關。勞海燕等[35]、王璐等[36]均采用了動態(tài)比濁法測定燈盞花素注射液的細菌內毒素，細菌內毒素檢測儀波長分別選擇了405、660 nm。所以無論選取哪種方式測定細菌內毒素均需先開展方法學驗證。

過敏反應：中藥注射劑成分多且復雜，產品在上市前采用豚鼠進行過敏實驗，因種屬與人類存在一定差異，可能在當時實驗條件下未能達到足以使實驗動物產生陽性癥狀的劑量，以此動物實驗數(shù)據(jù)推測人致敏的可能性時存在較大的風險。譚夢暉等[37]使用注射用燈盞花素誘導F344、SD、Wistar 3種品系大鼠產生被動皮膚過敏反應，3種品系大鼠隨機分組后給藥，大鼠同種被動皮膚過敏反應和大鼠-小鼠異種被動皮膚過敏反應結果均顯示3種品系大鼠對燈盞花素的敏感性存在差異，其中以F344大鼠最為敏感，得出選擇不同品系的動物至少2種以上進行過敏性安全評價，可提高檢測方法的靈敏度及結果的可靠性的結論。其研究團隊還用注射用燈盞花素誘導了豚鼠及大鼠的主動全身過敏反應[38]，燈盞花素對兩者均未表現(xiàn)出明顯的全身過敏反應癥狀，反應幾乎一致，BN大鼠表現(xiàn)出燈盞花素潛在的過敏反應，為中藥注射劑過敏性評價使用不同品種的實驗動物提供了參考依據(jù)。李黎明等[39]使用注射用燈盞花素比較研究了F344、BN、SD、Wistar 4種品系大鼠皮下注射后被動皮膚過敏及其致敏血清中Ⅰ型變態(tài)反應的抗體總IgE水平的差異，與譚夢暉等[37]的結果一致。谷舒怡等[40]采用腹腔致敏靜脈激發(fā)、口鼻霧化致敏激發(fā)2種途徑給予豚鼠燈盞花素注射液，燈盞花素注射液高、低劑量組動物均未出現(xiàn)明顯過敏反應，高劑量組動物血清中組胺含量較陰性對照組升高，經(jīng)口鼻吸入燈盞花素注射液1 mg·kg-1可能存在潛在過敏反應。譚夢暉等[41]給KM種小鼠足跖皮下注射燈盞花素，發(fā)現(xiàn)燈盞花素處理側腘窩淋巴結質量和細胞計數(shù)均顯著高于對側，可知KM小鼠對燈盞花素具有一定的過敏性。

毒性研究：注射劑型燈盞花素制劑具有生物利用度高、起效快等特點，在危疾病證急救及感染性疾病治療上具有一定的優(yōu)勢。近年來，臨床使用該制劑的劑量有加大的趨勢，為了確定增加用藥劑量的安全性，觀察其毒性反應癥狀和毒性作用靶器官，已有研究者探索性地使用不同動物開展毒性研究，發(fā)現(xiàn)不良反應，更好地指導臨床用藥。謝琛靜等[42]觀察了注射用燈盞花素對比格犬呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及ICR小鼠協(xié)調功能和自發(fā)活性的影響，比格犬按體質量隨機分成3種不同劑量組和溶媒對照組，分別給藥后測定不同時間點心電圖、呼吸、血壓和肛溫，單次靜脈給予注射用燈盞花素對比格犬的呼吸、心血管系統(tǒng)及體溫無明顯影響；ICR小鼠按個體質量分成不同劑量3組和溶媒對照組，分別尾靜脈給藥后觀察機體協(xié)調能力，單次給予注射用燈盞花素對小鼠協(xié)調功能無明顯影響，500 mg·kg-1注射用燈盞花素對雌性小鼠在2 min時會產生一過性的輕度軀體運動障礙或中樞抑制作用。劉向云等[43]探討了注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬的毒性病理學差異，大鼠、比格犬分別給予不同劑量注射用燈盞花素3個月，每天1次，恢復期觀察1個月，麻醉采血后，取大鼠或犬大腦、小腦、骨髓、甲狀腺、唾液腺、腎上腺、胰腺、氣管、心肺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、脾、淋巴結，病理制片后觀察，大鼠各臟器均無明顯異常改變，比格犬給藥期分別在肝、胃、肺、腎、脾和淋巴結出現(xiàn)不同程度的損傷，損傷情況因劑量而不同，注射用燈盞花素對臟器的毒性反應存在中樞差異。梁玉記等[44]比較了比格犬和食蟹猴在使用了注射用燈盞花素后的體內毒性，2種實驗動物對注射用燈盞花素的耐受性、敏感性和毒性反應均存在種屬差異，兩者的表現(xiàn)差異明顯。王蓉蓉等[45]比較了不同廠家燈盞花素注射液的體外細胞毒性，不同廠家的產品細胞毒性差別較大，輔料聚山梨酯80也有細胞毒性，降低聚山梨酯80用量可提高安全性。

2.8 質量評價

注射劑型燈盞花素的生產廠家較多，不同的生產工藝、不同供應商的原料都可能影響產品的質量，為了評價不同產品的質量狀況，也為進一步提高產品質量標準提供參考，開展了同品種的質量評價。何玉川等[46]使用紫外分光光度法測定了3個不同廠家的7批燈盞花素注射液質量分數(shù)為98.75%～103.3%，差異不大，均符合質量標準要求。甄健存等[47]對比研究了不同廠家燈盞花素注射液、注射用燈盞花素的質量，建立了HPLC測定上述產品中野黃芩苷含量和有關物質的方法，發(fā)現(xiàn)有3批產品含量不符合質量標準要求；不同廠家產品有關物質存在顯著差異；注射用燈盞花素小規(guī)格產品的裝量差異大，說明生產廠家小規(guī)格產品裝量控制能力稍弱；顏色檢查均大于標準比色液黃色10號和黃綠色10號，甚至不同批次產品的溶液顏色存在明顯差異；不溶性微粒均符合質量標準要求。芮菁等[48]比較了不同廠家生產的含量測定合格的燈盞花素注射液在小鼠腦血栓形成實驗和小鼠腦循環(huán)障礙實驗中的反應情況，在同樣的檢測限值下，Ⅰ號樣品對小鼠腦血栓形成有顯著對抗作用，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號樣品則未見對抗作用；Ⅲ、Ⅳ號樣品對小鼠急性腦循環(huán)障礙改善有明顯作用，而Ⅰ、Ⅱ號樣品則差異不顯著；Ⅰ號樣品無細胞毒性反應的濃度與其他3個樣品無明顯差異。不同廠家生產的不同規(guī)格、不同批次的燈盞花素注射液雖然含量測定均符合規(guī)定，但生物活性卻存在明顯差異，說明“生物活性測定”與理化分析控制反映的產品質量結果可能不一致。葛建華等[49]在檢測中發(fā)現(xiàn)1批燈盞花素注射液紫外吸收波長產生了漂移，通過理化鑒別、薄層色譜法、紫外分光光度法、HPLC等對燈盞花素注射液中非法添加物進行了定性與定量分析，添加物呈維生素C鑒別的陽性反應，質量濃度為8.085 8 mg·mL-1。

3 結語

燈盞花素注射液、注射用燈盞花素均以燈盞花素為原料制成的供靜脈注射使用的注射劑。通過對比上述2個產品的質量標準，可知兩者存在一定差距，注射用燈盞花素質量控制相對嚴格。燈盞花素注射液水針劑建議結合現(xiàn)階段質量研究進一步提高質量控制水平，可適當增加溶液的顏色、總固體、熾灼殘渣、過敏反應、降壓物質、異常毒性等項目的檢查，優(yōu)化鑒別、有關物質、含量測定的方法。水針劑、粉針劑均有的項目(如蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子、熱原)可對比研究不同濃度的燈盞花素(野黃芩苷)對檢查結果的影響，從而確定最優(yōu)的檢查方法，真實準確地反映產品質量；2個產品還可考慮建立指紋圖譜(特征圖譜)和關鍵輔料的質量控制方法，整體提高該產品的質量控制水平。本文質量標準的對比分析為今后同品種產品的質量控制研究提供了參考，也為以燈盞花素為原料的中藥注射液質量標準提高指明了研究方向。

燈盞花素注射劑劑型的產品質量評價研究中顯示，不同廠家的產品質量存在一定差距。這一現(xiàn)狀可能主要與不同制劑企業(yè)的原料來源、生產設備、工藝參數(shù)控制等有關，最終在產品質量中表現(xiàn)出來。針對這一現(xiàn)狀，建議制劑企業(yè)在固定原料來源的基礎上，進一步提高工藝控制能力，把影響產品質量的關鍵參數(shù)、關鍵生產環(huán)節(jié)精細化管控，保證批間產品質量的穩(wěn)定，為臨床用藥的有效性、安全性做好基礎。