許小婷，汪 月，王 琳，曾憲卓

隨著世界人口日趨老齡化，癌癥正在成為引起人類非正常死亡的最重要原因，目前在全球每年有大約1 000萬人死于各種癌癥[1]。傳統(tǒng)的治療癌癥手段如放療、化療和手術(shù)治療等已逐漸進(jìn)入平臺期。近年來，腫瘤免疫療法研究取得了重要進(jìn)展，腫瘤免疫細(xì)胞治療受到越來越多的關(guān)注，預(yù)示著免疫細(xì)胞治療有望成為繼手術(shù)、化療、放療、靶向治療后惡性腫瘤治療領(lǐng)域的又一場革新[2]。基于免疫細(xì)胞的臨床應(yīng)用越來越廣泛，如何有效的大規(guī)模培養(yǎng)免疫細(xì)胞也顯得尤為重要。但目前大多數(shù)的免疫細(xì)胞培養(yǎng)都是采用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法，具有無法實(shí)現(xiàn)單次培養(yǎng)單元滿足一個患者的細(xì)胞使用量、占地面積大、無法監(jiān)控導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)批次產(chǎn)生顯著差異、培養(yǎng)周期長、勞動強(qiáng)度大及人力成本高等缺陷。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)瓶培養(yǎng)相比，使用生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)具有自動化、全程條件可控、動態(tài)培養(yǎng)可以提供一個更加穩(wěn)定和均勻的培養(yǎng)環(huán)境和具有大規(guī)模工業(yè)化潛力的優(yōu)點(diǎn)，可以從根本上解決傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量少、穩(wěn)定性差、易污染、工作量大及周期長等問題[3]。本研究選用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器(rotating wall-vessel bioreactor,RWV)培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞，與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法進(jìn)行比較，驗(yàn)證各培養(yǎng)組CIK細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞因子分泌情況及腫瘤殺傷活力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 8名男性健康成年人志愿者外周血標(biāo)本，50 mL/份，EDTA抗凝，無菌采集。

1.1.2 RWV RWV(自主研發(fā);專利號：ZL201520729703.8)，包括具有容納凹部的底座以及與該底座相適配的頂蓋；底座的容納凹部內(nèi)設(shè)有可拆卸的細(xì)胞培養(yǎng)盒，且細(xì)胞培養(yǎng)盒內(nèi)具有階梯柱形的細(xì)胞培養(yǎng)空間；底座上還設(shè)有用于驅(qū)動該底座以底座中軸線為軸進(jìn)行自轉(zhuǎn)的驅(qū)動裝置。圖1。

圖1 RWV示意圖

RWV可通過培養(yǎng)盒滿足不同個性化個體細(xì)胞培養(yǎng)的要求，培養(yǎng)過程從小量到大量的過度。常規(guī)的電機(jī)或馬達(dá)等驅(qū)動裝置很容易的使底座進(jìn)行自轉(zhuǎn)攪拌，RWV避免了常規(guī)發(fā)酵罐用渦輪式旋流或者是攪拌棒攪拌等方式產(chǎn)生的機(jī)械沖擊和剪切力造成的細(xì)胞損傷[4]。RWV的主要優(yōu)點(diǎn)是沒有攪拌剪切力，可以為細(xì)胞的生長提供一個相對溫和的三維環(huán)境；另一個特點(diǎn)是具有隨機(jī)化的重力向量，可能直接影響細(xì)胞基因的表達(dá)，或者間接促進(jìn)細(xì)胞的自分泌/旁分泌，從而影響細(xì)胞的增殖分化和組織器官形成。RWV可用于當(dāng)前十分熱門的組織工程研究，也可用于探索微重力環(huán)境對細(xì)胞生長、分化等的影響[5]。

1.1.3 主要試劑 RPMI-1640、PBS(美國Gibco公司)；肝素(美國Sigma-Aldrich公司)；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)；IL-2，IFN-γ，TNF-α因子ELISA試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；FITC標(biāo)記的CD3、CD4、CD8單抗，PE標(biāo)記的CD56單抗(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 外周血單核細(xì)胞分離 取外周血20 mL(20 mg/L肝素抗凝)，按1∶1的比例，用1xPBS稀釋外周血。另取一支離心管中加入Ficoll，將血樣沿離心管壁緩慢注加于Ficoll表面(Ficoll：稀釋血=1∶1)，20 ℃，1 500 r/min，離心30 min。吸取外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)層(中間白膜層)移入另一支試管，加入5倍體積PBS，1 800 r/min，離心5 min，棄上清，再次加入5倍體積PBS，1 800 r/min，離心5 min，棄上清。RPMI1640洗滌1次5 min。以RPMI-1640培養(yǎng)基和10% AB型血清重懸，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h去貼壁細(xì)胞，吸取懸浮細(xì)胞，備用。

1.2.2 體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞 利用成人外周血提取的PBMC以RPMI1640和10% AB型血清重懸并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液，加入IFN-γ 1 000 U/mL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，第1天加入抗CD3mAb終濃度為50 μg/L的IL-1β和IL-2，終濃度分別為105U/L和3×105U/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，隔日進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基以維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度[(0.5～1.5)×106/mL]，培養(yǎng)數(shù)天后，在無菌操作的條件下將細(xì)胞轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 分組 將CIK細(xì)胞以0.6×107/mL的密度接種到RWV中，設(shè)置反應(yīng)器的溫度為37℃、轉(zhuǎn)速7～10 r/min及培養(yǎng)基的循環(huán)率為5 r/min，作為RWV組。同時以相同的密度接種到T-Flask培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(放置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng))，作為傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)瓶組(CTRL組)。

1.2.4 培養(yǎng)體系效能評價

1.2.4.1 活細(xì)胞計數(shù) 分別從T-Flask培養(yǎng)瓶中和RWV取樣口中取樣1 mL細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/mL，取9滴細(xì)胞懸液移入小試管，加入1滴0.4%臺盼藍(lán)溶液，混勻。在3 min內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，鏡下死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞拒染。在誘導(dǎo)培養(yǎng)后第4、8、10、12、14、17、21和24天取培養(yǎng)的CIK細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，除以初始細(xì)胞數(shù)，得出實(shí)際擴(kuò)增倍數(shù)。并繪制各組細(xì)胞的生長曲線圖，記錄各組間的細(xì)胞增殖情況。

1.2.4.2 細(xì)胞因子分泌水平檢測 各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21和24天分別取1 mL CIK細(xì)胞懸液，充分洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL培養(yǎng)24 h后，收集上清，用ELISA法定量測定免疫細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2，IFN-γ，TNF-α變化情況，設(shè)4個平行孔。

1.2.4.3 細(xì)胞毒性檢測 細(xì)胞毒活性的分析，采用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)法。選擇K562作為靶細(xì)胞，將5 mL/dL小牛血清與RPMI1640混合后的培養(yǎng)液調(diào)整靶細(xì)胞濃度為1×105/mL；將混合液加至96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)定3個復(fù)孔，設(shè)置陰性對照組(靶細(xì)胞自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞)加100 μL培養(yǎng)液；陽性對照組各加入100 μL 1g/dL NP40；在每孔中加入100 μL效應(yīng)細(xì)胞，效靶比設(shè)置為5∶1、10∶1、20∶1；陰性對照組中的3個復(fù)孔用100 μL培養(yǎng)液替代效應(yīng)細(xì)胞；將孔板放置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h；用自動生化分析儀檢測LDH數(shù)值計算細(xì)胞殺傷活性。殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-靶細(xì)胞的自然釋放A值-效應(yīng)細(xì)胞的自然釋放A值)/(靶細(xì)胞的最大釋放A值-靶細(xì)胞的自然釋放A值)。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞的增殖能力比較 對2組分別在培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21和24天進(jìn)行臺朌藍(lán)染色后，對活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并繪制生長曲線(圖2)。結(jié)果顯示在第4天以后，RWV組的細(xì)胞增殖速度開始超過CTRL組。CTRL組的細(xì)胞從第4天開始增殖，增殖高峰在第17天，增殖平臺為第14～17天，隨后細(xì)胞數(shù)量減少。RWV組的細(xì)胞也在第4天開始增殖，增殖高峰在第21天。從生長曲線中可以看出，在第4天各組的細(xì)胞開始出現(xiàn)增殖后，RWV組以后的每個時間段的細(xì)胞增殖數(shù)量都多于CTRL組。

注：CIK細(xì)胞數(shù)量增殖變化，與CTRL組比較，在培養(yǎng)的第14天(t=3.55,**P<0.01)、第17天(t=3.451,**P<0.01)、第21天(t=5.197,****P<0.000 1)、第24天(t=4.856,****P<0.000 1)；組間比較，F(xiàn)=12.85，P=0.007 1圖2 CIK細(xì)胞生長曲線變化趨勢

2.2 細(xì)胞因子分泌水平比較 結(jié)果顯示(圖3)，2組細(xì)胞在第4天分泌IL-2因子的水平開始升高，RWV組在第21天IL-2因子分泌水平達(dá)到高峰(151.27±2.65)pg/mL，CTRL組在第17天達(dá)到高峰(138.33±2.10)pg/mL。RWV組在第10天之前與CTRL組的IL-2因子分泌水平無差異。但在第14天以后RWV組的CIK細(xì)胞分泌IL-2因子量一直高于CTRL組。

注：CIK細(xì)胞分泌IL-2因子濃度，與CTRL組比較，在培養(yǎng)的第14天(t=2.878,*P<0.05)、第21天(t=4.939,****P<0.000 1)、第24天(t=3.358,*P<0.05)；組間比較，F(xiàn)=14.87，P=0.004 8圖3 CIK細(xì)胞分泌IL-2因子水平表達(dá)情況

CTRL組CIK細(xì)胞分泌的IFN-γ在第21天達(dá)到高峰(209.00±2.58)pg/mL，RWV組也是在第21天達(dá)到高峰(252.80±4.07)pg/mL。在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第10天RWV組的CIK細(xì)胞分泌IFN-γ開始高于CTRL組(圖4)。

注：CIK細(xì)胞分泌IFN-γ因子濃度，與CTRL組比較，在培養(yǎng)的第17天(t=3.514，**P<0.01)、第21天(t=3.371，*P<0.05)、第24天(t=3.973，**P<0.01)；組間比較，F(xiàn)=18.27，P=0.002 7圖4 CIK細(xì)胞分泌IFN-γ因子水平表達(dá)情況

CTRL組分泌的TNF-α因子在第17天前都高于RWV組，第20天后則反之。CTRL組的TNF-α因子分泌在第17天達(dá)到高峰(251.25±3.02)pg/mL，RWV組則在第21天達(dá)到高峰(274.00±4.11)pg/mL(圖5)。

注：CIK細(xì)胞分泌的TNF-α因子濃度，與CTRL組比較，RWV組在培養(yǎng)的第21天(t=3.518，**P<0.01)、第24天(t=4.265，***P<0.001)；組間比較，F(xiàn)=11.01，P=0.010 6圖5 CIK細(xì)胞分泌TNF-α因子水平表達(dá)情況

2.3 CIK細(xì)胞毒性比較 結(jié)果顯示(表1)，在不同效靶比條件下，RWV組的殺傷率明顯優(yōu)于CTRL組，差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在不同的效靶比下，2組殺瘤率隨著效靶比的增大而加大，但RWV組的殺瘤率都大于CTRL組。

表1 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，細(xì)胞治療作為繼手術(shù)、放療和化療后發(fā)展的第4類腫瘤治療方法，在各種癌癥等難治性疾病的治療中發(fā)揮越來越重要的作用。免疫細(xì)胞可通過調(diào)控激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)來對抗、抑制和殺滅癌細(xì)胞。多項(xiàng)研究與臨床驗(yàn)證表明[6]，免疫細(xì)胞具有較好的擴(kuò)增性能和強(qiáng)的殺瘤活性，并對自身組織沒有細(xì)胞毒性等優(yōu)勢。因此，其應(yīng)用價值日益受到重視。1986年，Lanier等[7]第一次報道了CIK細(xì)胞，具有3種非MHC限制性細(xì)胞毒性的細(xì)胞亞群，即CD3+CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56+和CD3-CD16-CD56bright細(xì)胞。CIK細(xì)胞在外周血中僅占不到5%。研究發(fā)現(xiàn)[8]，CIK細(xì)胞的免疫表型主要是CD3+CD56+細(xì)胞。CIK細(xì)胞是將PBMC用多種細(xì)胞因子共刺激，體外培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞[9]，能同時表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子[10]，兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)[11]。尤其對手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，提高機(jī)體免疫力。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已經(jīng)顯示[12]，CIK細(xì)胞能夠提高腫瘤患者生活質(zhì)量，延長患者生存期。

基于免疫細(xì)胞的臨床應(yīng)用越來越廣泛，如何有效的大規(guī)模培養(yǎng)免疫細(xì)胞也顯得尤為重要。目前免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增的難點(diǎn)是如何確保細(xì)胞批次間的質(zhì)量穩(wěn)定。使用生物反應(yīng)器擴(kuò)增免疫細(xì)胞技術(shù)可以從根本上解決傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量少[13]、穩(wěn)定性差、易污染、工作量大及周期長等問題[14]，有效地降低臨床治療成本。

本研究中使用自主研發(fā)的RWV對免疫細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)研究。以傳統(tǒng)的體外擴(kuò)增培養(yǎng)為對照組，對各組進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測、細(xì)胞因子分泌水平檢測和細(xì)胞毒性檢測。結(jié)果都顯示了RWV培養(yǎng)具有較長的CIK細(xì)胞生長周期，細(xì)胞增殖數(shù)量大大提高；對于CIK細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ、TNF-α進(jìn)行濃度檢測，2組間差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，RWV組的CIK細(xì)胞因子分泌水平明顯高于CTRL組。研究結(jié)果表明，RWV的CD3+CD56+細(xì)胞增殖高峰在培養(yǎng)的第21天，IL-2、IFN-γ、TNF-α因子的表達(dá)高峰在第17～21天，這提示在CIK細(xì)胞的回輸治療中，應(yīng)在生物反應(yīng)器培養(yǎng)的第17天后回輸，治療效果更佳。LDH法檢測細(xì)胞毒性結(jié)果顯示經(jīng)RWV培養(yǎng)后的CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷活力。

本研究一定程度上解決了免疫細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞活性喪失、細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量不足的難題。除此之外，研究小組還開發(fā)了具有高效擴(kuò)增免疫細(xì)胞并有效維持其免疫活性的培養(yǎng)體系，并與RWV相結(jié)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模自動化細(xì)胞培養(yǎng)的雛形，一定程度上滿足了臨床的細(xì)胞質(zhì)量要求。但因各個生物反應(yīng)器存在差異，其控制系統(tǒng)還不夠穩(wěn)定，難免培育出的細(xì)胞會存在質(zhì)量上的差異，因此，需要進(jìn)一步對生物反應(yīng)器進(jìn)行調(diào)試組裝升級，才能實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)機(jī)的生產(chǎn)與使用，加快進(jìn)入“工廠式”的大規(guī)?；詣优囵B(yǎng)工業(yè)級標(biāo)準(zhǔn)化的臨床級細(xì)胞。

經(jīng)過幾十年來的研究與實(shí)踐，雖然生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)還存在著不少問題，但較之前已是質(zhì)的飛躍，隨著這一技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，我們需將不斷努力，研制出更理想的生物反應(yīng)器，以獲得更高密度、高活力的細(xì)胞；開發(fā)新的無血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞的生長狀態(tài)更好，生物制品更安全；建立細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的渦合系統(tǒng)，充分利用培養(yǎng)液，以降低生產(chǎn)成本等，從而使細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物制品制備和基因工程等領(lǐng)域得到更廣泛的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。