張桐碩，劉金龍，趙 躍，王朵朵，宋姜楠，陳 曉，郭小芹，李艷秋，祝 峰

卵巢癌是致死率高的婦科腫瘤，對(duì)患者生理及心理產(chǎn)生巨大的危害。卵巢癌組織來源復(fù)雜，包括上皮性、間質(zhì)性、生殖細(xì)胞來源。其中，上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是最常見的組織類型，占卵巢腫瘤的50%～70%，卵巢惡性腫瘤的90%～95%[1]。EOC發(fā)病隱匿，缺少令人滿意的腫瘤標(biāo)志物，制約著EOC預(yù)后的改善，近15年我國卵巢癌生存率未見升高[2]。挖掘EOC發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控分子，對(duì)尋找體外預(yù)警和監(jiān)測方法等轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具有重要意義。炎癥與腫瘤的關(guān)系是近些年的研究熱點(diǎn)。炎性微環(huán)境在腫瘤的惡性演進(jìn)中發(fā)揮促進(jìn)作用，這一觀點(diǎn)被越來越多的模型證實(shí)[3]。天然免疫應(yīng)答細(xì)胞釋放的炎性因子以旁分泌和自分泌的方式控制腫瘤的生長。其中，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)被認(rèn)為是銜接炎癥與腫瘤最為核心的炎癥因子。然而，既往關(guān)于EOC中IL-6的臨床報(bào)道多為簡單地比較外周血或腹水中IL-6水平的高低差異[4]，或用以評(píng)估預(yù)后表現(xiàn)[5]，缺乏與EOC分期整體性的相關(guān)性分析，而且對(duì)IL-6水平增高的成因闡述薄弱，其生物學(xué)意義尚待深入研究。本研究從EOC血清樣本出發(fā)，初步分析IL-6隨分期進(jìn)展的變化趨勢，借助高效的生物信息學(xué)分析手段，進(jìn)一步從基因?qū)用娣治鯥L-6的水平差異，為開發(fā)IL-6在EOC中的潛在價(jià)值提供新線索。

1 資料和方法

1.1 EOC血清中IL-6的水平檢測

1.1.1 研究對(duì)象 選取武警特色醫(yī)學(xué)中心婦科2017年2月—2018年6月間收治的原發(fā)性EOC患者21例，中位年齡51(25～77)歲。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2013年版手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期7例，Ⅱ期5例，Ⅲ期6例，Ⅳ期3例。另收集我院同期收治的卵巢良性疾病患者12例作為陽性良性對(duì)照組，中位年齡42(17～60)歲，包括卵巢良性粘液性囊腺瘤4例、卵巢單純囊腫4例、巧克力樣囊腫2例及卵巢纖維瘤2例。健康體檢婦女30例作為正常對(duì)照組，中位年齡44(24～70)歲。所有對(duì)象均排除心、肝、腎等重要臟器疾患，不合并自身免疫性疾病，近期無感染。采血前均未行手術(shù)、放療或藥物治療。均與患者簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 樣本采集及檢測 抽取受檢者的靜脈血3 mL于促凝采血管中，3 000 r/min離心10 min，再取1 mL上清于無酶凍存管中，-80 ℃保存。待所有血樣收集完畢后，整批采用ELISA法檢測IL-6水平。人類IL-6免疫檢測試劑盒購自美國R&D Systems公司，OD值檢測使用美國Thermo Scientific公司的全自動(dòng)酶標(biāo)儀，具體操作嚴(yán)格按說明書。每個(gè)樣本以3次檢測的平均值作為其血清IL-6的水平。

1.2 EOC病理組織中IL-6基因表達(dá)水平及生物信息學(xué)分析

1.2.1 基因數(shù)據(jù)來源 從公共基因表達(dá)(gene expression omnibus，GEO)(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫下載EOC組織芯片數(shù)據(jù)集：GSE9891(285例)、GSE26193(107例)、GSE54388(16例)。從癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載Nature雜志發(fā)文總結(jié)的卵巢癌mRNA表達(dá)RNASEqV2數(shù)據(jù)集，包含489例高級(jí)別漿液性卵巢癌組織，覆蓋不同的FIGO分期，其中198例包含脈管浸潤的病理信息。

1.2.2 共同差異基因篩選 對(duì)各數(shù)據(jù)集樣本的IL-6 mRNA水平由高到低進(jìn)行排序，前50%的樣本作為高表達(dá)組，后50%的樣本作為低表達(dá)組。對(duì)于GEO數(shù)據(jù)庫的3個(gè)數(shù)據(jù)集，通過GEO2R分析平臺(tái)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)提取IL-6高、低分組間的差異基因。對(duì)于TCGA的數(shù)據(jù)集，利用R語言的Limma程序包提取差異基因。按照FDR<0.05,Log2FC>1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選出各數(shù)據(jù)集中差異明顯的基因繪制Venn圖，選取在3個(gè)及以上數(shù)據(jù)集的交集基因用于后續(xù)分析。

1.2.3 GO和KEGG通路富集分析 使用DAVID在線生物信息學(xué)分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)篩選出的IL-6高、低表達(dá)組間的差異基因進(jìn)行生物學(xué)注釋和分類，分別完成基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書通路(the Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway，KEGG)富集分析。GO富集分析又分為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)類型板塊，每個(gè)類型取富集程度最高的6個(gè)條目作圖展示。

1.2.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將篩選出的差異基因和IL-6導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，獲得差異基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。利用Cytoscape軟件對(duì)高度可信(結(jié)合系數(shù)大于0.7)的互作關(guān)系進(jìn)行可視化處理，生成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。再利用Cytoscape的MCODE插件根據(jù)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮匦詫?duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類構(gòu)建子模塊，定位IL-6所在的子網(wǎng)絡(luò)模塊，挖掘出與IL-6關(guān)系密切的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；EOC與2個(gè)對(duì)照組的血清IL-6數(shù)據(jù)均呈非正態(tài)分布，故IL-6水平以中位數(shù)表示；組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni校正；TCGA數(shù)據(jù)庫中是否發(fā)生脈管浸潤的2組IL-6 mRNA比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；血清IL-6水平與FIGO分期的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)；以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EOC患者血清IL-6的水平以及與FIGO分期的關(guān)系 正常對(duì)照組、良性對(duì)照組與EOC組的血清IL-6水平分別為5.88(3.83～6.87)pg/mL、13.24(8.53～27.70)pg/mL和27.76(14.57～80.92)pg/mL，整體間差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。經(jīng)過3組之間的兩兩比較，只有EOC組高于正常對(duì)照組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)，圖1A。通過Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血清IL-6與FIGO分期的等級(jí)數(shù)存在明顯正相關(guān)(r=0.79，P=0.002)，圖1B。

2.2 EOC組織IL-6 mRNA與脈管浸潤以及FIGO分期的關(guān)系 在TCGA數(shù)據(jù)的EOC樣本中，IL-6 mRNA在不同F(xiàn)IGO分期整體間有顯著差異(P=0.001)，且隨FIGO Ⅰ～Ⅲ依次升高(FIGO Ⅰ與Ⅱ：P=0.007，F(xiàn)IGO Ⅱ～Ⅲ：P=0.016)。Ⅳ期的IL-6轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)回落(P=0.039)，圖2A。IL-6 mRNA的水平在脈管浸潤狀態(tài)下高于非浸潤狀態(tài)(P=0.027)，圖2B。

2.3 IL-6高、低表達(dá)組中的共同差異基因 從GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫收集到4個(gè)數(shù)據(jù)集共計(jì)897例EOC樣本的基因表達(dá)譜。GSE9891、GSE26193、GSE54388和TCGA中符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的差異基因各自有485個(gè)、417個(gè)、768個(gè)和1 260個(gè)，至少3個(gè)樣本集共有的差異基因有199個(gè)。相比于IL-6低表達(dá)組，高表達(dá)組中有156個(gè)表達(dá)上調(diào)，43個(gè)表達(dá)下調(diào)。

2.4 差異基因的富集分析 GO富集分析顯示，199個(gè)表達(dá)差異基因主要參與了細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、細(xì)胞粘附能力調(diào)控、膠原蛋白的合成以及中性粒細(xì)胞趨化作用引發(fā)的炎癥反應(yīng)等一系列生物過程；參與合成的膠原蛋白、基底膜等產(chǎn)物多分布于細(xì)胞外基質(zhì)，是腫瘤微環(huán)境的重要組分；參與的分子功能除構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)外，還包括與調(diào)控肝素、整合素、細(xì)胞外基質(zhì)分子與其配體的親和性，進(jìn)而影響細(xì)胞和外環(huán)境的信號(hào)傳遞轉(zhuǎn)導(dǎo)。KEGG通路富集分析顯示，這些差異基因涉及的信號(hào)通路覆蓋細(xì)胞外基質(zhì)受體互作、凝血功能、致癌因子等方面，主要有各類致病菌感染所激活的通路，調(diào)節(jié)慢性炎癥反應(yīng)的Toll樣受體、NF-κB信號(hào)通路，以及與增殖和凋亡等生物效應(yīng)密切相關(guān)的PI3K/Akt、TNF信號(hào)通路。

注：A:EOC組與對(duì)照組的血清IL-6水平(3組間Kruskal-Wallis H檢驗(yàn) P=0.035)；B:血清IL-6水平與FIGO分期的相關(guān)性分析圖1 EOC患者血清IL-6的水平以及與FIGO分期的關(guān)系

注：A:FIGOⅠ～Ⅳ期的IL-6 mRNA水平(4組間Kruskal-Wallis H檢驗(yàn) P=0.001)；B:EOC發(fā)生脈管浸潤與否的狀態(tài)下的IL-6 mRNA水平圖2 EOC組織IL-6 mRNA與EOC分期進(jìn)展的關(guān)系

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 圖3展示了差異基因所對(duì)應(yīng)蛋白的相互作用關(guān)系。IL-6在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中居于核心地位，周邊與IL-6結(jié)合系數(shù)較高的鄰接基因有SOCS3、FOS、IL8、CCL2、JUNB、IL7R、PTPRC(圖3A)。利用MCODE插件進(jìn)行更深層的分子功能模塊挖掘，挑選出包含IL-6且聚類分值排序最靠前的子模塊，其內(nèi)部節(jié)點(diǎn)為CCL2/3、C1QA/B、PTPRC、VSIG4、CD163，可能在IL-6調(diào)控的范圍內(nèi)發(fā)揮重要作用(圖3B)。

注：基因節(jié)點(diǎn)均以圓圈表示，節(jié)點(diǎn)大小代表與該基因有直接互作關(guān)系的基因數(shù)目(連接度越高，圓圈越大)；節(jié)點(diǎn)之間連線的粗細(xì)代表其互作關(guān)系的結(jié)合系數(shù)；紅色節(jié)點(diǎn)代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因圖3 卵巢癌IL-6相關(guān)差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

IL-6可由單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞分泌至微環(huán)境中，并可以到達(dá)血液循環(huán)而被檢測到。既往絕大多數(shù)研究中可觀察到卵巢癌患者的血清IL-6高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)術(shù)前較高的血清IL-6水平與較短生存期或不良預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。本研究亦得到相似結(jié)果，正常對(duì)照組、良性對(duì)照組與EOC組的血清IL-6平均值依次增高。然而，組間兩兩比較的結(jié)果顯示，EOC組與良性對(duì)照組未見顯著差異(P=0.318)，考慮是由于IL-6水平的個(gè)體差異較大，導(dǎo)致組間的別差不易出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究各組內(nèi)的IL-6水平均呈偏態(tài)分布，與先前報(bào)道中的IL-6分布特點(diǎn)基本一致，因此，在分析IL-6與FIGO分期的關(guān)系時(shí)，不宜采取將不同分期拆分對(duì)比差異的統(tǒng)計(jì)方式，而應(yīng)選用Spearman相關(guān)分析來評(píng)估IL-6隨分期進(jìn)展的變化趨勢。結(jié)果顯示，血清IL-6與FIGO分期的相關(guān)系數(shù)較大，呈正相關(guān)。組織中的IL-6 mRNA變化趨勢與血清IL-6基本保持了一致。值得注意的是，IL-6 mRNA在脈管浸潤狀態(tài)下上調(diào)，而脈管浸潤的出現(xiàn)常提示EOC發(fā)生潛在轉(zhuǎn)移?？梢奍L-6與EOC的分期進(jìn)展密切相關(guān)，對(duì)監(jiān)測EOC的進(jìn)程具備一定的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

探究IL-6在EOC惡性演進(jìn)中相關(guān)基因和通路，有助于理解IL-6與以上病理特征的聯(lián)系，為IL-6的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。綜合GO和KEGG通路富集分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分差異基因所參與的功能和通路可歸納到上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mensenchymal transition，EMT)的范疇。細(xì)胞重定位是EMT的重要步驟，即卵巢上皮細(xì)胞從基底膜轉(zhuǎn)移到膠原纖維構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)中[6]，而細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞粘附能力及其附屬類別集中的IL-6相關(guān)差異基因數(shù)目最多。目前已有研究證實(shí)，IL-6可通過上調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[7]。

KEGG通路富集分析包含多種感染性疾病，只代表IL-6在EOC中介導(dǎo)的慢性炎癥與細(xì)菌感染引起的炎癥啟動(dòng)了相似的信號(hào)通路，包括了Toll樣受體、PI3K/Akt、NF-κB和TNF信號(hào)通路等腫瘤界的明星通路，與IL-6一同構(gòu)成廣泛而復(fù)雜的EOC進(jìn)展調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。Toll樣受體是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的紐帶，可能與腫瘤抗凋亡能力以及免疫逃逸有關(guān)。Szajnik等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體相關(guān)激動(dòng)劑可導(dǎo)致卵巢癌的NF-κB通路活性增加，并產(chǎn)生IL-6等炎癥因子。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)IL-6可通過活化PI3K/Akt通路來增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的粘附和侵襲能力。Kulbe等[10]報(bào)道，TNF-α可誘發(fā)產(chǎn)生血管生成因子,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的種植和新生血管的形成，而TNF-α基因敲除的卵巢癌細(xì)胞則表現(xiàn)出非侵襲性和高凋亡率。

深入分析IL-6相關(guān)差異基因的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CCL2、PTPRC和CD163不但在整個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中與IL-6的結(jié)合系數(shù)較高，而且出現(xiàn)在IL-6的功能子模塊中，這3個(gè)分子可能是IL-6調(diào)控卵巢癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。CCL2作為趨化因子家族的重要一員，能招募免疫抑制性白細(xì)胞聚集到卵巢癌細(xì)胞的周圍的微環(huán)境中，誘導(dǎo)其浸潤轉(zhuǎn)移[11]，推測IL-6可能通過升高EOC細(xì)胞表面CCL2的濃度從而提高其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。CD163也被稱血紅蛋白清道夫受體，是單核-巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)記[12]。有學(xué)者認(rèn)為CD163可以通過炎性因子影響凋亡相關(guān)蛋白的水平從而抑制細(xì)胞凋亡，還可以通過調(diào)節(jié)EMT參與腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。PTPRC即CD45，免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面均有表達(dá)，在Toll樣受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及白細(xì)胞的粘附和遷移中發(fā)揮重要作用[14]。近年來的研究多集中在PTPRC對(duì)造血系統(tǒng)腫瘤的靶向治療，但尚未見PTPRC與卵巢癌的相關(guān)報(bào)道，其在卵巢癌中的意義還有待探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清IL-6在EOC中高表達(dá)，其升高程度與反映病灶轉(zhuǎn)移擴(kuò)散情況的FIGO分期呈正相關(guān)。繼而通過生物信息學(xué)分析揭示，IL-6相關(guān)差異基因的功能特征主要集中在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面，與IL-6水平隨分期進(jìn)展而升高的規(guī)律相吻合，也解釋了作為腫瘤轉(zhuǎn)移始動(dòng)因素的脈管浸潤伴發(fā)IL-6轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的現(xiàn)象。鑒于血清IL-6在人群中的基礎(chǔ)值范圍跨度較大，且特異性不強(qiáng)，雖然不足以用于卵巢癌的早期篩查，但有望作為一種無創(chuàng)的輔助指標(biāo)追蹤卵巢癌的進(jìn)程，并配合CA125、HE4等經(jīng)典卵巢癌標(biāo)志物，改善EOC的診斷與管理。