姚夢纖謝辰莊志祥

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma NPC）是臨床上常見的惡性腫瘤，發(fā)生在人體的鼻咽腔頂部和側(cè)壁，臨床上以放療為主[1]。多數(shù)地區(qū)NPC患者放療的5年生存率仍不高，僅為40%[2]，仍對居民生命健康構(gòu)成嚴重威脅。NPC 5年生存率不高的原因可能與發(fā)現(xiàn)時機、腫瘤分期、病理類型及治療方案等諸多因素有關(guān)[3]。治療前，若能有效預(yù)測NPC的預(yù)后，便于臨床上及時調(diào)整治療方案，而目前臨床上用于NPC預(yù)后判斷相關(guān)指標的特異度和靈敏度仍不高，無法滿足臨床診療需求[4]。因此，尋找一種有效預(yù)測NPC預(yù)后的生物標記物尤為重要。近年來，miRNA作為研究熱點，其中miR-1181參與多個腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其表達水平與預(yù)后有關(guān)[5]。miR-1181是否會影響NPC的預(yù)后，目前鮮有報道。本研究通過分析72例鼻咽癌患者的miR-1181表達水平，探討miR-1181表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療鼻咽癌預(yù)后判斷提供參考。現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1 臨床資料

選取2013年2月～2014年9月因鼻咽癌到我院進行治療的72例患者作為研究對象。納入標準：①符合西班牙醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)會鼻咽癌臨床指南（2017）[9]的鼻咽癌臨床診斷標準；②患者均未進行放療、化療等特殊治療；③患者自愿簽署知情同意書。排除標準：①合并其他腫瘤者；②合并嚴重心、肺功能不全者；③合并嚴重凝血功能障礙者；④不積極配合本次研究者。將72例患者納為觀察組，采集患者血清，并收集臨床資料。另選同期在我院體檢正常體檢，一般資料與觀察組均衡的72位健康人作為對照組，采集血清。觀察組男32例，女40例；年齡35～76歲，平均（54.26±12.28）歲；對照組男57例，女15例；年齡34～79歲，平均（53.86±11.88）歲。所有鼻咽癌患者根據(jù)WHO分類標準[10]進行分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期17例，Ⅲ期18例，Ⅳ期22例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

2 靜脈血采集及血清提取

收集兩組清晨空腹靜脈抽血約5ml到抗凝血液基因組DNA提取試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），在2～8℃下保存。將觀察組及對照組的靜脈血分別與Hanks平衡鹽溶液培養(yǎng)基按比例（1:1）混合，混合后鋪在分離液上。室溫下對混合液進行離心（1200rpm/min），離心10min，將收集的第一層血清層溶于Trizol試劑，為RNA提取備用。

3 熒光定量PCR檢測

將血清樣本使用Trizol細胞漿裂解液溶解，熒光定量PCR實驗使用Step-One系統(tǒng)進行處理。再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以U6作為內(nèi)參，分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為70℃10min，42℃50min，70℃10min，4℃保存。以U6作為內(nèi)參，實時熒光定量PCR反應(yīng)為25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃15min，94℃15s、55℃30s、70℃30s，45個循環(huán)。本研究的PCR引物序列如下，miR-1181：Forward 5’-GCCGAGCCGTCGCCGCCA-3’，Reverse 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6：Forward 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，Reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。為分析miR-1181表達水平與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系，定義2-△OCT＞2為高表達，2-△OCT≤2為低表達[11]。

4 隨訪

從患者出院時間開始隨訪，隨訪結(jié)束時間為2019年9月31日，共隨訪5年。通過電話隨訪或者門診的方式，了解患者的生存情況（包括疾病特異性生存、無轉(zhuǎn)移生存、局部無復(fù)發(fā)生存），終點事件為刪失、隨訪時間截止、死亡，總生存期為出院時間至終點事件時間。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1 兩組患者血清中miR-1181的表達水平

觀察組miR-1181相對表達水平（3.56±1.04）與對照組miR-1181表達水平（6.57±2.21）對比，顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)定量熒光PCR血清miR-1181水平，將72例鼻咽癌患者分為血清miR-1181高表達組和血清miR-1181低表達組，見圖1。

2 miR-1181對鼻咽癌細胞的影響

miR-1181的溶解曲線是單峰型，表明內(nèi)參照的擴增產(chǎn)物結(jié)果較好，并沒有出現(xiàn)其他非特異性產(chǎn)物或者引物二聚體。miR-1181的溶解曲線和擴增曲線見圖2。

3 miR-1181表達水平與病理資料的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示miR-1181低表達與鼻咽癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.002）、腫瘤分期（P=0.009）以及臨床分期（P=0.001）密切相關(guān)，與患者的年齡、性別以及組織分化程度無顯著相關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 miR-1181表達水平與病理資料的相關(guān)性分析（例）

4 miR-1181表達水平與鼻咽癌患者生存率的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-1181的表達水平與鼻咽癌患者DSS（r=0.854，P=0.003）、MeFS（r=0.851，P=0.005）及LRFS（r=0.862，P=0.002）呈正相關(guān)。此外，DSS、MeFS及LRFS與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及臨床分期密切相關(guān)，與年齡、性別及組織分化程度無明顯的相關(guān)性（見表2）。多變量生存分析結(jié)果顯示，低表達組5年疾病特異性生存率、無轉(zhuǎn)移生存率、局部無復(fù)發(fā)生存率均高于高表達組（HR=2.154，2.365，2.368；P=0.031，0.027，0.033）（見圖3），表明miR-1181低表達是鼻咽癌生存預(yù)后的一個預(yù)測因子，預(yù)示著咽癌患者的DSS（P=0.031，HR=2.154）、MeFS（P=0.027，HR=2.365）及LRFS（P=0.033，HR=2.368）較差（見表3）。

表2單變量log-rank分析

注：各變量中DSS、MeFS與LRFS的病例有重合。

表3多變量生存分析

討論

miRNA是大小長約20～25個核苷酸的非編碼RNA，具有高度的保守性，在不同生物中起著相仿的生物功能[6]，被證實在細胞增殖、凋亡、激素分泌、及腫瘤分化、轉(zhuǎn)移等過程起著重要的作用[7，8]。目前已證實的miRNA超過500個，預(yù)計總數(shù)超1000個，并且可調(diào)控人類基因的約占30%[9，10]。其中miR-1181參與多個腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其表達水平與預(yù)后有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-1181的表達水平與NPC預(yù)后有關(guān)，血清miR-1181水平越高，NPC預(yù)后越好。這可能與miR-1181生物調(diào)控功能有關(guān)。①miR-1181表達水平與STAT3狀態(tài)有關(guān)[11]。目前STAT3是STAT家族最普遍存在的成員，被生長因子或細胞因子刺激后，作用于細胞核，以二聚體的形式與DNA片段特異性結(jié)合，調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄[12]。STAT3在轉(zhuǎn)錄激活以及信號傳導(dǎo)上均發(fā)揮重要作用，若信號通路被持續(xù)激活，會引起細胞惡性增殖、周邊侵襲[13]。STAT3可通過各種靶基因（如血管生成因子、細胞周期調(diào)控因子、抗凋亡基因等）促進腫瘤的發(fā)展[14]。miR-1181表達水平與STAT3的表達水平呈負相關(guān)，NPC患者STAT3狀態(tài)呈中高水平，易發(fā)生STAT3磷酸化（p-STAT3）,持續(xù)激活信號傳導(dǎo)通路，參與腫瘤細胞的增值、轉(zhuǎn)移[15]。②miR-1181表達水平與F-肌動蛋白(F-actin)狀態(tài)有關(guān)[16]。F-actin通過調(diào)控細胞膜活動參與單核細胞的細胞免疫活動，經(jīng)過合成分解調(diào)節(jié)機制對細胞膜進行控制，但此機制易遭到破壞，引起細胞異常生長、分裂、轉(zhuǎn)移、增殖，導(dǎo)致細胞癌變[17]。miR-1181表達水平與F-actin的表達水平呈正相關(guān)，NPC患者中F-actin被剪切呈現(xiàn)低表達水平，導(dǎo)致其極性和運動結(jié)構(gòu)的缺失，從而引起細胞的遷移能力變?nèi)鮗18]。相關(guān)研究[19]顯示Factin表達水平升高其腫瘤TNM分期均低于低表達患者，可能與F-actin高表達造成細胞活動能力升高有關(guān)，F(xiàn)-actin高表達越高，轉(zhuǎn)移率越低，F(xiàn)-actin表達水平與腫瘤預(yù)后呈正相關(guān)。Hua X等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-1181下調(diào)，提示鼻咽癌預(yù)后不佳，并通過調(diào)節(jié)wnt/β-catenin信號促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移，與本研究結(jié)果一致。由于本研究樣本容量較小，研究結(jié)果可能存在一定的偏倚，還需更大樣本容量的研究進一步證實。

綜上所述，miR-1181低表達與鼻咽癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，miR-118可能在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等起著重要的作用，可能成為鼻咽癌患者預(yù)后的生物標志物。