謝曉東，李濤，袁海文，文明,3，周碧君,2，楊美,3，程振濤,3*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008；3. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025 )

牛支原體(Mycoplasmabovis)是引起牛支原體肺炎的主要病原，M.bovis感染除引起牛支原體肺炎外，還會引起耳炎、結(jié)膜角膜炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥、乳腺炎、流產(chǎn)等癥狀，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[1]。牛支原體黏附素主要以膜蛋白形式存在于細胞表面，對牛支原體的致病性起重要作用。而在牛支原體膜表面蛋白眾多研究熱點當(dāng)中，Vsp蛋白因為其抗原表位和大小都具有高頻的變異性而研究資料較多[2-3]。Vsp 蛋白家族是一組與牛支原體黏附性密切相關(guān)的膜脂質(zhì)蛋白，它能夠協(xié)助牛支原體黏附在宿主細胞上，從而產(chǎn)生相關(guān)的致病性。此外，牛支原體還有pMB67、P26抗原、28 kD蛋白等其他黏附相關(guān)蛋白[4]。牛支原體膜表面蛋白的研究對揭示該病原致病與免疫機理有重要意義[5]，p81蛋白為牛支原體的表面膜蛋白，研究資料認(rèn)為其也是一種特異性抗原蛋白，p81蛋白有高度的保守性且種間差異較大[7]，如牛支原體PG45株的p81蛋白與無乳支原體的p81蛋白的同源性只有64%。2009年，我國學(xué)者李媛等[6]選用p81基因設(shè)計引物，建立了牛支原體雙重PCR方法。此方法特異性強、靈敏度高，因而牛支原體p81基因可以作為靶向基因用來診斷牛支原體。本文通過對牛支原體貴州株p81基因的克隆，測序及生物信息學(xué)分析，獲取牛支原體貴州株p81基因分子特征，為基于p81蛋白致病性、免疫防控和診斷研究提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 菌株

M.bovisGZ01、M.bovisGZ02由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室分離并保存；M.bovis標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45(ATCC25533)購自美國典型菌種保藏中心。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購自Biomiga公司，2×Taq PCR Master Mix、200 bpDNA Maker購自北京天根生化科技有限公司，pMD-19T載體購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司，DNA限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司。

1.3 目的基因擴增

根據(jù)NCBI公布牛支原體基因序列設(shè)計一對引物，上游引物p81-p1：5′-TTATTTAAGAATTTGACTTGAT-3′；下游引物p81-p2：5′-GAAAAATAAATTAATGATTGGGCTT-3′，預(yù)擴增片段長2 187 bp，由大連寶生物工程有限公司合成。提取2株牛支原體貴州分離株和牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45基因組，應(yīng)用引物p81-p1/ p81-p2對目的基因進行擴增。

1.4 p81基因克隆及序列分析

將PCR擴增的目的基因膠回收與純化，純化的基因與pMD-19T載體連接轉(zhuǎn)化入宿主菌，對重組載體進行PCR及酶切鑒定。陽性重組質(zhì)粒由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。采用DNAStar 7.1和Mega 5.0軟件對牛支原體貴州株p81基因進行氨基酸推導(dǎo)及進化關(guān)系分析。

1.5 p81基因生物信息學(xué)分析

采用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/compute PI/MW)和Protparam(http://web.expasy.org/protparam)分析預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)及氨基酸組成；采用在線軟件Protscale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/)分析蛋白疏水性與親水性；采用在線軟件SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services.SingnalP)和TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白信號肽以及預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；采用在線軟件NetNGlyc 1.0、NetPhos 2.0和NetPhosk 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測蛋白潛在N糖基化位點、潛在磷酸化位點以及保守的特異性蛋白激酶作用位點；采用在線軟件PHD sec(http://www.predictprotein.org/)和(Immune Epitope Database,IEDB)(http://www.iedb.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；利用DNAStar 7.1提供的蛋白質(zhì)氨基酸序列抗原表位在線預(yù)測工具，進行B細胞抗原表位預(yù)測和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 p81基因PCR 擴增

以提取的牛支原體培養(yǎng)物DNA為模板，PCR擴增獲得牛支原體貴州株p81基因，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。PCR擴增獲得大小約為2 187 bp目的條帶(圖1)，與預(yù)期擴增片段相符。

M.DL 2000 Marker；1、2. 牛支原體GZ01；3、4. 牛支原體GZ02；5、6. 牛支原體PG45；7.空白對照圖1 p81基因片段PCR擴增結(jié)果

2.2 p81基因PCR 克隆及序列分析

2.2.1 陽性重組質(zhì)粒篩選

牛支原體GZ01、牛支原體GZ02 p81目的基因經(jīng)膠回收純化、連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒后進行質(zhì)粒PCR鑒定(圖2)，可見從重組質(zhì)粒中擴增獲得約為2 187 bp的目的條帶，與目的基因大小一致。

M.DL 2000 Marker；1、2、3. 牛支原體GZ01 p81基因重組質(zhì)粒；4、5、6. 牛支原體GZ02 p81基因重組質(zhì)粒；7.陰性對照圖2 陽性重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.2.2 陽性重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳電泳結(jié)果見圖3。重組質(zhì)粒雙酶切可見約2 187 bp的目的基因條帶和2 962 bp的載體條帶，結(jié)果證實，目的基因克隆成功。

M.DL 2000 Marker；1. 牛支原體GZ01 p81基因重組質(zhì)粒；2. 牛支原體GZ02 p81基因重組質(zhì)粒；2、4.陰性對照圖3 陽性重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2.3p81基因推到氨基酸序列分析

經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序，對氨基酸序列進行推導(dǎo)分析。由圖4可見，p81基因序列編碼728個氨基酸，推導(dǎo)氨基酸55 位、230 位、485 位、558位密碼子為TGA，可作為終止密碼子，但對于牛支原體p81基因為色氨酸，如進行蛋白表達需進行位點突變。將2株M.bovis貴州株氨基酸序列與參考株P(guān)G45氨基酸序列進行比較顯示, 2株分離自貴州省不地區(qū)的M.bovis貴州株氨基酸序列完全相同，但與PG45株p81蛋白氨基酸序列發(fā)生110位點突變。此結(jié)果表明，貴州省內(nèi)M.bovis菌株p81蛋白保守，但相較于標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45株已出現(xiàn)明顯進化。

圖4 牛支原體貴州株p81基因推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 p81蛋白理化性質(zhì)的分析

應(yīng)用ExPASy(Compute PI/MW)、Protparam在線分析軟件預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及氨基酸組成。p81蛋白分子質(zhì)量為 81.629 6 kD，分子結(jié)構(gòu)式為C3643H5795N963O1133S13。理論等電點為9.15。其氨基酸組成中Lys(K)最多，占13.5%，含有1個Cys(C)(0.1%)，堿性氨基酸有3種(Arg、His、Lys)，共121個，占16.6%；推測p81為堿性蛋白。該蛋白溶液中不穩(wěn)定指數(shù)為29.15，低于閾值40，在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。這些指數(shù)提示p81蛋白應(yīng)具有較好的抗原性。

2.4 p81蛋白疏水性及親水性的預(yù)測與分析

應(yīng)用Protscale在線預(yù)測牛支原體貴州流行株p81氨基酸序列的親疏水性，結(jié)果見圖5。

圖5 p81基因親疏水性分析

圖中縱坐標(biāo)大于0的為疏水區(qū)，得分越高疏水性越強；反之，則為親水區(qū)。p81基因編碼的蛋白多肽鏈第18位具有最高分，為2.156(疏水性最強)，在616位具有最低分，為-3.178(親水性最強)。Scale分析得知，整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，較好的親水性也預(yù)示著較高的可溶性。

2.5 p81蛋白信號肽及跨膜區(qū)預(yù)測

應(yīng)用在線軟件SignalP 4.0和TMHMM 2.0分析此蛋白信號肽以及預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖6。牛支原體貴州株p81基因所編碼氨基酸在24～25間具有分泌信號肽的特征，因此表達時建議該蛋白基因進行修飾。由圖7可知，該蛋白不具有明顯的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，有利于提升p81基因表達效果。

圖6 p81信號肽分析

圖7 p81跨膜區(qū)分析

2.6 p81蛋白修飾結(jié)構(gòu)的預(yù)測

應(yīng)用在線軟件采用在線軟件NetNGlyc1.0、NetPhos 2.0和NetPhosk1.0 預(yù)測蛋白潛在N糖基化位點、潛在磷酸化位點以及保守的特異性蛋白激酶作用位點。由圖8可知，p81蛋白在第167，314，328，493和559個氨基酸處共存在5個N糖基化位點；p81蛋白有59個絲氨酸、29個蘇氨酸及11個酪氨酸可能被磷酸化。上述磷酸化位點所對應(yīng)的磷酸激酶預(yù)測結(jié)果顯示，在p81蛋白上可能有PKC，UNSP，PKA，CKⅠ，DNAPK，RSK，INSR，CKⅡ，PKG，SRC，cdc2，ATM，EGFR共13種保守的特異性蛋白激酶的結(jié)合位點，其中在451處unsp得分最高為0.997。這些分析結(jié)果提示p81蛋白與牛支原體致病性存在相關(guān)關(guān)系。

圖8 p81蛋白修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 p81蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用在線軟件PHD sec和SWISSMODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，Sec預(yù)測組p81蛋白多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的3種類型分別是α-螺旋(H)、β-折疊(S)和無規(guī)則卷曲(L)，比率分別為27.61%、11.40%和60.99%，以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊較少。利用SWISS-MODEL預(yù)測p81基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖9所示，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相似。

圖9 p81蛋白三級結(jié)構(gòu)模型

2.8 p81蛋白B細胞抗原表位分析

采用Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Jamson-Wolf以及Emini方法，分別對p81蛋白的表面可及性、抗原指數(shù)、親水性、柔韌性進行預(yù)測。由圖10可見，該蛋白存在豐富的親水性區(qū)域，主要集中在27～168、312～546、645～716。p81蛋白有多個表面可及性程度高的肽段，分別是31～142、557～628。其他部分表面可及性較小，但均為正值。骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，且分布相對均勻。該蛋白整體抗原指數(shù)較高，120～168、428～484較大，其中25～169、196～292、426～628區(qū)域抗原優(yōu)勢明顯，上述區(qū)域可作為蛋白表達選擇的目標(biāo)區(qū)域。

圖10 p81蛋白B細胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

3 討論

牛支原體感染可造成養(yǎng)牛業(yè)巨大的經(jīng)濟損失，且其感染已呈現(xiàn)世界性分布[8]，因此國內(nèi)外均加強了牛支原體地方流行株的研究。牛支原體感染的主要癥狀為咳嗽、呼吸困難，從開始流清亮鼻液到后期轉(zhuǎn)為黏性或者膿性鼻液，剖檢可見胸腔積液、與肺部發(fā)生粘連、肺臟質(zhì)地變硬并出現(xiàn)壞死灶[9-10]。目前對牛支原體診斷較為困難，常用方法主要為牛支原體病原分離鑒定和基因檢測[11-12]。但在病原分離培養(yǎng)時，由于牛支原體對營養(yǎng)需求較高，耗時長，臨床分離易受其他微生物污染，因此不能作為臨床快速診斷手段[13]；而針對牛支原體基因和血清抗體檢測，因其高通量、高靈敏性和快速高效特性，常被應(yīng)用于臨床診斷技術(shù)，但此方法以特異性基因和抗原蛋白的選擇為基礎(chǔ)。因此，開展牛支原體相關(guān)功能蛋白基因的生物信息學(xué)分析，是有效選擇靶標(biāo)蛋白的手段，也是構(gòu)建亞單位疫苗或基因工程疫苗的必備步驟。吳燕等[14]通過對綿羊支原體肺炎p113基因生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)p113蛋白可能是潛在信號通路分子，也是一種良好的抗原結(jié)構(gòu)蛋白；對豬支原體A1基因編碼蛋白進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在跨膜區(qū)域，具有良好抗原性[15]。因此，本研究選擇牛支原體p81基因，開展目的基因的序列分析，推導(dǎo)分析氨基酸的特性，為基于牛支原體p81基因的表達、亞單位疫苗構(gòu)建、診斷試劑和致病性研究提供可行性分析資料。

牛支原體不具有細胞壁，其細胞膜由脂質(zhì)雙分子層和膜蛋白組成，牛支原體主要通過支原體細胞膜成分發(fā)揮致病作用，包括支原體黏附、增殖、入侵宿主細胞、免疫應(yīng)答等[16-18]。目前的研究資料認(rèn)為，p81應(yīng)為牛支原體膜蛋白[19]，具有開展診斷試劑、基因工程疫苗、亞單位疫苗研究的可能性。本文通過對牛支原體貴州株p81基因擴增，并分別進行推導(dǎo)氨基酸編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、預(yù)測二級與三級結(jié)構(gòu)以及B細胞抗原表位分析，結(jié)果均提示，p81蛋白具有作為抗原蛋白的優(yōu)勢。本研究還發(fā)現(xiàn)，55位、230位、485位、558位密碼子為TGA，可作為終止密碼子，但牛支原體p81基因為色氨酸，如進行蛋白表達需進行位點突變；高黎萍[20]在進行p25、p33蛋白表達時，為使基因能在在大腸桿菌中進行正確表達而將TGA突變?yōu)榫幋a色氨酸的TGG，最終成功或獲得p25、p33目的蛋白。針對抗原蛋白的體外表達，需要考慮表達量、表達蛋白區(qū)段抗原指數(shù)、信號肽區(qū)域、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域等因素選擇合適的表達區(qū)段。本文對M.bovisp81蛋白的B細胞抗原表位、信號肽區(qū)域、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域分析顯示，p81蛋白在24～25位氨基酸區(qū)域存在信號肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，其中25～169、196～292、426～628區(qū)域抗原優(yōu)勢明顯，綜上分析，認(rèn)為對p81蛋白表達如選擇N端區(qū)域，需考慮去除信號肽，并對可能存在TGA進行突變。而如選擇包含426～628的C端進行表達，則需對存在的TGA進行突變。