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弓形蟲MIC10基因的克隆與表達(dá)

2020-08-14 06:23:46張煊承李航謝素珠趙少偉王浩張爽賈立軍
畜牧與獸醫(yī) 2020年8期
關(guān)鍵詞:弓形蟲宿主質(zhì)粒

張煊承,李航,謝素珠,趙少偉,王浩,張爽,賈立軍

(東北寒區(qū)肉??萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心,延邊大學(xué),吉林 延吉 133002)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種專性胞內(nèi)機(jī)會(huì)性致病原蟲,呈世界范圍流行,廣泛感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游?,能夠引起?yán)重的人畜共患傳染病[1-2]。貓科動(dòng)物既是其終末宿主,也是其中間宿主之一,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)弓形蟲的中間宿主無選擇性,涵蓋了各種動(dòng)物和人[3]。弓形蟲基因型分類主要為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和非典型基因型,并且每種基因型之間差異較大[4]。Ⅰ型蟲株的毒性最強(qiáng),如RH株;Ⅱ、Ⅲ型的致病能力則較弱,如PLK株和PRU株[5-7]。弓形蟲其生活史的各個(gè)階段的抵抗力大不相同,滋養(yǎng)體的抵抗力最弱,卵囊的抵抗力則最強(qiáng),但其每個(gè)階段均具有感染性,對(duì)人類的生命健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重的威脅[8]。

微線體蛋白MIC可根據(jù)是否具有跨膜結(jié)構(gòu)分為兩類,其中微線體蛋白MIC10屬于不具有跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白。TgMIC10異于其他的MIC蛋白,在蟲體的速殖子期和緩殖子期都存在表達(dá),在前者中的含量約為后者的3倍。成熟的MIC10的分子量為18 kD,它的前導(dǎo)肽序列十分長,由58個(gè)氨基酸構(gòu)成,而成熟的誘導(dǎo)肽序列是由9個(gè)二谷氨酸重復(fù)和1個(gè)不完全的重復(fù)序列組成,且誘導(dǎo)肽不含有半胱氨酸[9]。針對(duì)重組MIC10制造的抗體可以識(shí)別天然MIC10,通過間接免疫熒光試驗(yàn)等對(duì)MIC10基因蛋白進(jìn)行定量,可以幫助區(qū)分急性感染和慢性感染[10]。本試驗(yàn)對(duì)MIC10基因進(jìn)行克隆和表達(dá),以期為該基因及其轉(zhuǎn)錄蛋白的結(jié)構(gòu)、功能分析及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株與血清

Vero細(xì)胞、弓形蟲RH株由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;小鼠抗弓形蟲陽性血清、弓形蟲陰性血清均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備、保存。

1.2 試劑

ExTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker等均購自大連寶生物工程有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司;BL21感受態(tài)購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司;蟲體DNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上登錄的弓形蟲基因序列(XM_002367312.2),使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成特異性引物,預(yù)期597 bp。2條引物5′端分別引入了BamHⅠ和XhoⅠ限制酶切位點(diǎn)。引物由上海英濰捷基有限公司合成。上游引物F1:5′-CGCGGATCC-ATGGCGCTTTCTTCTTTGAACA-3′;下游引物F2:5′-CCGCTCGAGCTACATCGATTTCCTGCGTCT-3′。

1.4 MIC10基因PCR擴(kuò)增

將獲得的弓形蟲DNA作為模版,用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系25 μL:模板DNA 1.5 μL,dNTP 1 μL,上下游引物各1 μL,10×Buffer 2.5 μL,Taq酶0.3 μL,去離子水17.7 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃進(jìn)行預(yù)變性5 min,94 ℃進(jìn)行變性1 min,54 ℃退火90 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸7 min后,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.5 MIC10基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及測序

將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體連接后,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定和XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定,并將鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。

1.6 MIC10基因原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

用XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切PGEX-4T-1原核表達(dá)載體,膠回收載體片段。將重組質(zhì)粒的酶切膠回收產(chǎn)物與PGEX-4T-1載體的酶切膠回收的產(chǎn)物,連接16 ℃過夜。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定和XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定,1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定結(jié)果。

1.7 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。每隔2 h取菌液,離心沉淀,并裂解后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。以小鼠抗弓形蟲陽性血清作為一抗,以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲MIC10基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以弓形蟲的DNA為模板,PCR后得到MIC10基因的目的片段。將產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后得到597 bp目的條帶,擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小相同。見圖1所示。

M. DL 2000 DNA Marker;1、2. MIC10目的基因擴(kuò)增片段;3. 陰性對(duì)照?qǐng)D1 MIC10基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組克隆質(zhì)粒鑒定與測序分析

重組質(zhì)粒pMD18-T-MIC10經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定,PCR擴(kuò)增出597 bp的目的片段,見圖2所示。經(jīng)XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切后,獲得約597 bp的目的條帶與2 692 bp的載體片段,見圖3所示。序列測定分析的結(jié)果表明,獲得的弓形蟲MIC10基因序列與GenBank上弓形蟲基因序列(XM_002367312.2)同源性為100%。

M. DL 2000 DNA Marker; 1、2. pMD18-T-MIC10 PCR產(chǎn)物; 3. 陰性對(duì)照?qǐng)D2 pMD18-T-MIC10 PCR鑒定

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. pMD18-T-MIC10酶切片段圖3 pMD18-T-MIC10雙酶切鑒定

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-MIC10鑒定

對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-MIC10進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定,PCR擴(kuò)增出597 bp的目的片段,見圖4所示。

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. PGEX-4T-1 PCR產(chǎn)物;3. 陰性對(duì)照?qǐng)D4 PGEX-4T-MIC10 PCR鑒定

經(jīng)XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切后,獲得約597 bp的目的條帶和4 969 bp 的載體條帶,見圖5所示。

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. PGEX-4T-1雙酶切片段圖5 PGEX-4T-MIC10酶切鑒定

2.4 重組蛋白表達(dá)分析

分別取IPTG誘導(dǎo)前樣品和誘導(dǎo)后每2 h的樣品,進(jìn)行SDS-PAGE,在約49 kD處出現(xiàn)MIC10基因與載體共同表達(dá)蛋白的目的條帶,說明重組蛋白表達(dá)正確,見圖6所示。Western blot分析表明,該蛋白能被小鼠抗弓形蟲陽性血清所識(shí)別,具有較好的反應(yīng)原性(圖7)。

M.蛋白質(zhì) Marker; 1. 誘導(dǎo)前MIC10; 2. 誘導(dǎo)2 h MIC10; 3. 誘導(dǎo)4 h MIC10; 4. 誘導(dǎo)6 h MIC10; 5. 誘導(dǎo)8 h MIC10圖6 重組MIC10蛋白SDS-PAGE電泳鑒定

M. 蛋白質(zhì) Marker; 1. 誘導(dǎo)前MIC10; 2. 誘導(dǎo)后MIC10; 3. 陰性對(duì)照?qǐng)D7 重組MIC10蛋白Western blot分析

3 討論

作為頂復(fù)體門寄生蟲,弓形蟲和肉孢子蟲等一樣為專性寄生蟲,而且弓形蟲為人獸共患病,嚴(yán)重危及人類的生命安全[1]。自弓形蟲被發(fā)現(xiàn)以來,對(duì)它的研究從未中斷過,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,弓形蟲的感染與致病機(jī)制逐漸被明確,但是如何在感染早期及時(shí)準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)機(jī)體被感染仍值得探討。

弓形蟲侵襲和附著宿主細(xì)胞靠它的3個(gè)主要細(xì)胞器產(chǎn)生的蛋白,即棒狀體蛋白、致密顆粒蛋白和微粒體蛋白。蟲體侵襲過程中最先產(chǎn)生微線體并黏附宿主細(xì)胞,隨即棒狀體釋放內(nèi)容物形成納蟲泡,最后致密顆粒蛋白進(jìn)入納蟲泡形成納蟲泡膜,完成整個(gè)侵襲過程。研究較多的微線體蛋白主要有MIC2和MIC5,MIC2的主要功能是幫助蟲體黏附宿主細(xì)胞,MIC5則不具有黏附結(jié)構(gòu),已證實(shí)MIC5具有診斷價(jià)值,而且與急性弓形蟲病患者血中分離到的診斷抗原H4序列相同。

MIC10是微線體蛋白中發(fā)現(xiàn)較晚的,但是查閱EST數(shù)據(jù)庫可以發(fā)現(xiàn),MIC10出現(xiàn)頻率較高[9]。MIC10的全長序列為198個(gè)氨基酸,二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋,由于缺乏跨膜域,MIC10與宿主細(xì)胞受體綁定,因此MIC10可以從感染部位擴(kuò)散形成循環(huán)抗原,而用于弓形蟲病的診斷。在速殖子快速增殖的急性感染期MIC10大量表達(dá),蛋白水平遠(yuǎn)高于其他階段,因此MIC10可以作為區(qū)別急性和慢性感染的主要指標(biāo)。為了進(jìn)一步探討MIC10的功能,制備能夠穩(wěn)定且高效表達(dá)MIC10蛋白的表達(dá)載體是研究的關(guān)鍵。本試驗(yàn)從NCBI上查閱到弓形蟲MIC10基因的堿基序列,用Primer 5.0設(shè)計(jì)MIC10基因的特異性引物,并在Blast上做了驗(yàn)證,確保了試驗(yàn)所用引物的可靠性。本試驗(yàn)成功擴(kuò)增了大小為597 bp的MIC10基因片段,構(gòu)建pMD18-T-MIC10克隆質(zhì)粒和PGEX-4T-MIC10原核表達(dá)載體,經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定正確,并在大腸桿菌中成功表達(dá),表達(dá)蛋白的分子量約為49 kD。本試驗(yàn)為弓形蟲MIC10基因功能的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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