李玉燕，李貴陽，沈巍，鞏新民,祝永華，張霞,沈霞，王傳堂，張承新，劉曉陽，郭龍宗*

(1. 山東益生畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，山東 煙臺 250000；2. 青島英賽特生物科技有限公司，山東 煙臺 250000 )

支原體感染是雞群中普遍存在的一種感染，在大型養(yǎng)殖公司的集約化飼養(yǎng)的雞群，支原體感染尤為嚴(yán)重。對雞群有明顯致病性的支原體主要有二種，即滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae, MS)和雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)[1]。MG是致病性最強(qiáng)、引起經(jīng)濟(jì)損失最大的家禽支原體病原[2]。臨床以胸、腹氣囊炎病變?yōu)橹?，可引起商品代雛雞死淘率增高、料重比增加和蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)減少，且常與其他呼吸道病原混合感染，造成更大經(jīng)濟(jì)損失。我國在 20 世紀(jì)60 年代開展對此病的研究，20 世紀(jì)90年代的調(diào)查顯示，我國雞群 MG 陽性感染率為 50%～80%[3]。該病可垂直和水平傳播，其中種雞的垂直傳播會給下游企業(yè)帶來持續(xù)不斷的感染，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，在行業(yè)內(nèi)引起廣泛重視，也是可凈化的一種重要垂直傳播性疾病，該病在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)實現(xiàn)凈化，而國內(nèi)該病的感染還十分嚴(yán)重。

控制支原體疾病一般采用活疫苗或活疫苗+滅活苗結(jié)合免疫，應(yīng)用較為廣泛的活疫苗菌株有F株、6/85株、TS-11等，而環(huán)境中支原體感染性強(qiáng)毒株有R株、S株等。TS-11、F株MG疫苗株可在雞的上呼吸道終生攜帶，并會干擾臨床樣品PCR的檢測結(jié)果，因此，無法通過簡單的PCR方法評估雞群中支原體的控制和凈化狀況。另外，在疫苗的應(yīng)用過程中其回復(fù)突變導(dǎo)致一定的毒力，基于弱毒活疫苗的有效性及安全性考慮，建立有效鑒別不同MG疫苗株和野毒株的方法十分重要。本研究對臨床免疫M(jìn)G活疫苗(6/85、TS-11)的雞群，采集咽喉拭子和毛蛋氣囊拭子、氣管、肺等疑似支原體感染樣品進(jìn)行MG的PCR檢測，建立了MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)與野毒株(S株、R株)的PCR鑒定方法，并對臨床檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，以期對MG的防控與凈化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCR引物由青島英賽特生物科技有限公司設(shè)計與合成，核酸提取試劑盒購自青島英賽特生物科技有限公司。PCR反應(yīng)試劑盒、瓊脂糖、TAE均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。 MG TS-11和F疫苗株(批號為MGS 170911A)作為TS-11陽性對照，購自澳大利亞生物資源；MG 6/85疫苗株(批號為02408208)，購自默沙東(中國)有限公司(MSD)，野毒株S6和R株陽性對照由南京天邦生物科技有限公司惠贈。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)計針對MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)與野毒株(S6株、R株)的引物，對臨床免疫M(jìn)G活疫苗TS-11的種雞群(A～I(xiàn)場)的后代啄殼死亡的毛蛋氣囊拭子、臨床送檢免疫6/85的雞群(J場)的氣管、肺、腹膜等疑似支原體感染樣品采用MG通用引物進(jìn)行PCR鑒定，對陽性DNA再分別用TS-11、F株、6/85、S6株、R株的特異性引物進(jìn)行鑒別診斷。種雞群TS-11在5周齡進(jìn)行滴眼方式免疫，種雞群6/85疫苗株在7周齡進(jìn)行噴霧方式免疫。對A場父母代后代死亡啄殼毛蛋持續(xù)存在氣囊炎的種雞群，同時采集咽喉拭子進(jìn)行MG的檢測，分析種雞群與后代雞群的MG流行感染狀態(tài)。采集山東益吉達(dá)SPF雞群咽喉拭子作為陰性對照組。最后對臨床采集樣品MG的PCR檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計分析。

1.3 樣品的采集與處理

咽喉拭子樣品的采集：將棉棒插入喉頭口及上顎裂處來回刮3～5次取咽喉分泌液，將樣品端插入離心管剪下或折斷，放入含有0.8～1.0 mL PBS的離心管中，備用。

氣囊拭子樣品的采集：將滅菌棉簽插入雛雞或毛蛋氣囊內(nèi)側(cè)，來回刮3～5次，將樣品端插入離心管，棉簽剪下或折斷，放入含有0.8～1.0 mL PBS的離心管中，備用。

分別采集病雞的肺臟、氣管、腹膜，加入2倍滅菌生理鹽水研磨，直至成為勻漿液。將懸液移至離心管中充分搖震后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min。取上清用0.22 μm濾器過濾，備用。

父母代和祖代雞群支原體病原監(jiān)測周齡為1、4、11、13、16、21、26、30、34、40、46、52及58周，每舍采集30對咽喉拭子。

祖代和父母代種雞群開產(chǎn)后，在30、32、34、37、40、43、46、49、52、55及58周檢測20～30枚啄殼死亡毛蛋，觀察氣囊是否渾濁，進(jìn)行氣囊評估，同時采集氣囊拭子進(jìn)行MG的PCR檢測。

毛蛋氣囊拭子DNA提取參照青島英賽特生物科技有限公司開發(fā)的咽喉拭子基因組DNA提取試劑盒的使用說明，從咽喉拭子和氣囊棉拭子擠出并離心的上清液提取DNA。

1.4 PCR引物

參照趙杰等[4]篩選出的針對MG序列的套式PCR引物，作為檢測MG的通用引物，由青島英賽特生物科技有限公司合成，擴(kuò)增片段為300 bp。MG疫苗株(TS-11、F、6/85)與野毒株(S6、R)的引物由青島英賽特生物科技有限公司設(shè)計合成，引物序列為：MG-TS11-F：GGTAAAAATCAATACAGTGTT-TTTC，MG-TS11-R:TGGACTCATATTTCTTTCTTTTGC；MG-F-F：ATCATTCTAAATGCTTCTCAACG,MG-F-R: TCTAATAGATCCGTTTGAGG；MG-6/85-F:TTTTATCCAGTAGTGGGTGC，MG-6/85-R: TGTGGTCTGAAACCTGCTCTTGGTTG；MG-S6-F: ACTCCTCGTCCATTCATTGCTAT， MG-S6-R: TCCCGATGTAATCGATAATCAAG；MG-R-F: AGGTCATACTTACGCTTGGAAAC，MG-R-R: TCGATAGAGTTAATTGACTATGAAAAG。MG疫苗株TS-11的目的片段為600 bp、MG疫苗株F株的目的片段為347 bp、MG疫苗株6/85的目的片段為500 bp、野毒株S6株的目的片段為310 bp、野毒株R株的目的片段為324 bp。

1.5 目的基因片段的擴(kuò)增

第1對引物反應(yīng)體系為25 μL。2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL，提取的DNA模板3 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

第2對引物套式PCR反應(yīng)體系同第1對引物，模板為第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(3 μL)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)與野毒株(S6株、R株)的引物反應(yīng)體系同MG套式PCR第1對引物反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束，取7 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外光線下觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群MG-PCR檢測

7周齡免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群于10周齡送檢5只存在氣囊炎病變的雞只，采集氣管、肺、氣囊拭子、腹膜等樣品進(jìn)行MG的PCR檢測，MG通用引物套式PCR檢測均為陽性(見圖1)，該引物已在文獻(xiàn)[1]中驗證。MG疫苗株6/85 PCR檢測均為陽性(見圖2)，MG野毒株S6的PCR檢測均為陽性，R引物的PCR檢測為陰性(見圖3)。這表明，該雞群在免疫后1個月左右仍能檢出MG 6/85疫苗株，同時存在MG野毒株S6的共感染。

M. DNA 2000 Marker；1～5.客戶雞群采集樣品；6. 陰性對照圖1 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群(J場)樣品MG套式PCR產(chǎn)物

M. DNA 2000 Marker；+. MG疫苗株6/85；-.陰性對照；1～5. 客戶雞群采集樣品圖2 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群(J場)樣品MG疫苗株6/85引物擴(kuò)增產(chǎn)物

M. DNA 2000 Marker；1-5. 客戶雞群采集樣品圖3 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的客戶雞群(J場)樣品MG野毒S6和R株引物擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場)后代啄殼死亡毛蛋的氣囊拭子的 MG-PCR 檢測

免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場)送檢后代啄殼死亡的毛蛋，采集氣囊拭子進(jìn)行MG的PCR檢測，通用引物套式PCR檢測均為陽性，MG野毒株S6和R株的PCR檢測均為陽性(見圖4、圖5)。這表明，該雞群后代同時存在MG野毒株S6和R株的共感染。

M.DNA 2000 Marker；1-4. 雞群(F場)采集后代啄殼死亡毛蛋氣囊拭子樣品圖4 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場)啄殼死亡的毛蛋氣囊拭子S6引物擴(kuò)增產(chǎn)物

圖5 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場)啄殼死亡的毛蛋氣囊拭子R引物擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 MG疫苗株F株的MG-PCR檢測

采用MG疫苗株F株驗證檢測方法針對F株引物的特異性，結(jié)果顯示MG通用引物套式PCR檢測均為陽性，MG疫苗株F株均為陽性，TS-11、6/85、S6、R株均為陰性(見圖6)。這表明，設(shè)計的F株引物針對MG疫苗株F株的特異性強(qiáng)。

M. DNA 2000 Marker；1-2. F株疫苗株圖6 F株疫苗株各MG鑒別引物F株、TS-11、6/85、S6、R株 PCR產(chǎn)物電泳

2.4 SPF雞群采集咽喉拭子的MG-PCR 檢測

采集山東益吉達(dá)SPF雞群132份咽喉拭子進(jìn)行MG的PCR檢測，結(jié)果顯示，MG通用引物套式PCR檢測均為陰性，MG疫苗株F株、TS-11、6/85，野毒株S6、R株均為陰性。表明該MG鑒別引物特異性強(qiáng)。

2.5 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11父母代種雞群(A～H場)和祖代種雞群(I場)后代啄殼的毛蛋氣囊拭子的MG-PCR檢測

祖代種雞群(I場)后代啄殼的447份毛蛋氣囊均無渾濁，氣囊拭子進(jìn)行MG-PCR檢測，結(jié)果顯示，通用引物套式PCR檢測均為陰性，MG疫苗株F株、TS-11、6/85，野毒株S6、R株均為陰性(見表1、表2)。同時祖代種雞群(I場)咽喉拭子的MG檢測也均為陰性。對A～H場父母代種雞群啄殼的毛蛋渾濁氣囊拭子，進(jìn)行MG-PCR檢測，結(jié)果見表2。

MG-套式PCR通用引物檢測均為陽性；A場和D場渾濁氣囊拭子中野毒S6的PCR陽性率均為100%；B場父母代渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽性率均為80%，S6 株P(guān)CR可疑率20%；C場父母代渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽性率分別為25%、75%，S6 株P(guān)CR可疑率75%；E場父母代渾濁氣囊拭子中只檢出TS-11，其余均為陰性；F場和H場渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽性率均為100%；G場渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽性率均為100%。不同父母代雞群后代啄殼的毛蛋渾濁氣囊陽性率有差別，H場父母代陽性率最低，為1.13%；F場父母代的陽性率最高，達(dá)16.89%(見表1)。

表1 父母代種雞和祖代種雞群后代啄殼毛蛋渾濁氣囊陽性率

2.6 A場父母代種雞群咽喉拭子和后代啄殼的毛蛋氣囊拭子MG-PCR檢測

A場父母代種雞群后代啄殼的毛蛋氣囊從50周齡開始出現(xiàn)病變，后期一直持續(xù)存在(見表3)。采集的渾濁氣囊拭子經(jīng)MG鑒別引物PCR檢測，可同時檢出野毒S6(見表2)。同時對A場父母代種雞群采集咽喉拭子，經(jīng)MG鑒別引物PCR檢測，也可檢出野毒S6。表明種雞群感染MG，可垂直傳播給后代。

表3 A場父母代各周齡后代啄殼毛蛋氣囊評估檢測結(jié)果統(tǒng)計

3 討論

在規(guī)模化養(yǎng)殖的雞群中，支原體感染是非常普遍的現(xiàn)象，特別是對雞致病性高的MG在雞群內(nèi)很容易通過呼吸道造成橫向傳播。此外，MG還能通過雞胚從種雞垂直傳播給后代，給下一代造成顯著放大的感染率[1]。目前控制MG的措施包括種群凈化、疫苗接種和藥物治療[3]。發(fā)達(dá)國家通過良好的生物安全措施，已經(jīng)凈化和控制了MG。山東益生種畜禽股份有限公司首次引進(jìn)的哈伯德(HBD)曾祖代通過疫苗免疫和嚴(yán)格的生物安全措施，進(jìn)行一個完整的飼養(yǎng)周期的持續(xù)觀察和檢測，真正實現(xiàn)了無MG和MS感染。這表明，在我國是完全可以通過生物安全來有效控制MG。通過抗體和病原體檢測證明，該公司可作為我國大型種雞場實現(xiàn)無MG和MS感染的成功示范[1]。本公司已經(jīng)把曾祖代雞群的成果示范的經(jīng)驗推廣向了祖代，通過對I場祖代雞群的MG持續(xù)跟蹤檢測，在采集的種雞群的咽喉拭子和后代啄殼的毛蛋氣囊拭子樣品中，PCR均未檢測到MG病原。

MG的活疫苗研究始于20世紀(jì)70年代，目前應(yīng)用的MG的活疫苗毒株包括TS-11、6/85和F株等，國內(nèi)使用的活疫苗為MG康涅狄克F株疫苗，我國也有MG活苗F36株。F株是應(yīng)用時間最長和最廣泛的疫苗，能明顯提高患病雞的產(chǎn)蛋量。近年來人們發(fā)現(xiàn)其具有引發(fā)感染的潛在威脅，F(xiàn)株免疫沒有取代其他毒株反而感染了未接種雞群，并可經(jīng)蛋傳播給子代雞[5]。MG 疫苗株TS-11是由澳大利亞田間分離株80083株經(jīng)化學(xué)誘變和溫度敏感(33 ℃)篩選方式研制的疫苗，具有毒性小、不易傳播的特點。對49日齡雞的疫苗安全性進(jìn)行了評價，發(fā)現(xiàn)TS-11菌株在體重、病變和臨床表現(xiàn)方面均具有良好安全性[6]。MG 6/85 株是由美國研發(fā)的疫苗，主要用于預(yù)防蛋雞產(chǎn)蛋下降，對產(chǎn)蛋率、蛋重和蛋殼強(qiáng)度影響不大，是目前比較安全的活疫苗[7]。目前我國市售活疫苗菌株主要是F36株，TS-11和6/85弱毒制作的疫苗比F株毒力更弱，對雞和火雞均無毒力，疫苗對未受MG感染的雞有較好的免疫效果，也可用于火雞的免疫接種[8]。因此，近年來TS-11株和MG 6/85株更多的被作為商品化弱毒苗用于雞和火雞。試驗證明，用 TS-11、6/85 兩種疫苗接種的雞群，主要是細(xì)胞免疫起重要作用，雖然也能產(chǎn)生保護(hù)作用，但血清中檢測不到抗體，不易判斷免疫效果[3]。另外，TS-11、F株疫苗株可在雞的上呼吸道終生攜帶，常規(guī)方法不易區(qū)分。

本研究建立的方法可有效區(qū)分MG疫苗毒(TS-11、6/85、F株)和野毒(S6、R株)，通過采集SPF雞群進(jìn)行MG鑒別引物的PCR結(jié)果顯示，該鑒別引物特異性強(qiáng)，不存在假陽性的弊端。MG 6/85疫苗株一般在呼吸道中存在一個月左右，本研究對7周齡免疫6/85的雞群，在10周齡采集氣囊炎病變的樣品進(jìn)行MG鑒別引物的PCR結(jié)果顯示，MG 6/85疫苗株檢測均為陽性，但該雞群也同時存在S6的野毒感染。通過采集免疫TS-11疫苗株(A～H場)雞群后代啄殼的毛蛋進(jìn)行觀察，氣囊渾濁毛蛋的陽性率存在極大的差別，H場父母代陽性率最低，為1.13%，而F場父母代的MG陽性率高達(dá)16.89%。在相同的免疫程序下，這種差別與每個場區(qū)的生物安全管理緊密相關(guān)。郭龍宗等[1]論述了生物安全對凈化MS和MG支原體的重要性，這一點在飼養(yǎng)規(guī)模較大的父母代場區(qū)中的作用尤為重要。同時采集免疫TS-11疫苗株雞群的后代啄殼毛蛋氣囊拭子進(jìn)行MG鑒別PCR 的檢測，結(jié)果顯示：渾濁氣囊拭子中野毒株S6和R株的陽性率的比例較高，部分場區(qū)可同時檢出這兩種野毒。通過對A場父母代種雞群采集咽喉拭子和后代啄殼毛蛋氣囊拭子進(jìn)行MG鑒別引物PCR檢測，結(jié)果表明種雞群MG的感染，可通過垂直傳播感染其后代。

綜上，本試驗建立的MG疫苗株和野毒株的PCR鑒別方法，可快速鑒別出臨床樣品的MG 疫苗株和野毒株，盡早發(fā)現(xiàn)MG野毒感染雞群，對MG 發(fā)病雞群盡快采取防治措施，最終為凈化MG 提供實際應(yīng)用價值。