王洪利，隋兆峰，于淼，姜平，王志遠(yuǎn)

(1. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是導(dǎo)致斷仔奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。PMWS主要特征是消瘦、呼吸困難、皮膚及可視黏膜蒼白或黃疸、腹股溝淋巴結(jié)腫大等，該病自1991年在加拿大出現(xiàn)以來，很快波及所有主要養(yǎng)豬國(guó)家，嚴(yán)重影響著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。我國(guó)在2000年通過血清學(xué)調(diào)査發(fā)現(xiàn)，北京、上海、天津、河北、江蘇等地的豬群中存在PCV2感染抗體[2]。

防控PCV2感染和流行，特定的血清學(xué)檢測(cè)必不可少。ELISA方法具有靈敏、快速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)人員要求不高，是適合于大規(guī)模檢測(cè)的方法。目前用于PCV2抗體檢測(cè)的方法主要是阻斷ELISA法和間接ELISA法。間接ELISA法有兩種，一種是以細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2全病毒作抗原的間接ELISA，另一種是以PCV2重組Cap蛋白作為包被抗原的間接ELISA。因后一種使用的包被抗原表達(dá)產(chǎn)量高，能有效區(qū)分PCV1與PCV2抗體，故得到了更為廣泛的應(yīng)用；阻斷ELISA法是以PCV2的細(xì)胞培養(yǎng)物為抗原，應(yīng)用重組Cap蛋白單克隆競(jìng)爭(zhēng)試劑，可特異性檢測(cè)PCV2抗體，適合大規(guī)模的檢測(cè)應(yīng)用[3-4]。Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，且具有型特異性。

本研究采用的以PCV2重組Cap蛋白作為包被抗原的間接ELISA試劑盒和阻斷ELISA試劑盒，為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室試制，對(duì)PCV2人工感染豬和自然感染豬抗體水平進(jìn)行檢測(cè)和分析，比較兩種ELISA試劑盒檢測(cè)效果，為PCV2感染的流行病學(xué)診斷、疫苗免疫效果評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株與佐劑

PCV2 SH株(106.0TCID50/mL)，為上海某豬場(chǎng)分離株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存與提供。

1.2 檢測(cè)試劑盒

PCV2阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室試制(批號(hào)為1101)；PCV2間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(商品名：豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒)，購(gòu)自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1.3.1 PCV2人工感染試驗(yàn)用豬

30～35 d健康豬15頭，PRRSV和PCV2病毒陰性及其抗體陰性，購(gòu)自江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司。

1.3.2 PCV2自然感染豬

來自浙江某規(guī)模豬場(chǎng)保育豬群。8周齡時(shí)部分保育仔豬陸續(xù)發(fā)病，主要癥狀為肌肉無力、呼吸困難、貧血、黃疸、下痢、生長(zhǎng)發(fā)育不良。病理剖檢見淋巴結(jié)顯著腫大，切面硬、呈白色；肺臟腫脹，堅(jiān)硬或似橡皮；肝萎縮；脾腫大及大面積梗死；腎腫大，被膜下有壞死灶；結(jié)腸水腫，腸黏膜充血或淤血，胃潰瘍。發(fā)病率為4%，病死率為43%。根據(jù)臨床表現(xiàn)，判斷該豬場(chǎng)發(fā)生了PMWS。PCR檢測(cè)患病豬血液樣品，證實(shí)了PCV2感染。該場(chǎng)未免疫PCV2疫苗。選擇亞臨床感染豬和發(fā)病豬各20頭。

1.4 PCV2人工感染試驗(yàn)

將15頭試驗(yàn)豬隨機(jī)分為3組，每組5頭，分別為對(duì)照組、PCV2攻毒組(PCV2)、PCV2攻毒后佐劑刺激組(PCV2+KHL)。PCV2組和PCV2+KHL組每頭豬接種PK15細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2 SH株(106.0TCID50/mL)，滴鼻和肌肉注射各2 mL，分別隔離飼養(yǎng)；PCV2+KHL組于攻毒后3 d，肌肉多點(diǎn)注射KHL各2 mL；空白對(duì)照組接種未感染病毒的PK15細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，滴鼻和肌肉注射各2 mL。

1.5 待檢血清的采集

分別于接種后的0、2、4、6、8、10周對(duì)人工感染豬前腔靜脈采血10 mL；發(fā)病豬場(chǎng)PMWS亞臨床感染豬和發(fā)病豬，于發(fā)病時(shí)(8周齡)前腔靜脈采血10 mL。在血液凝固后，離心分離血清，每份血清樣品分裝于4個(gè)滅菌1.5 mL離心管中，每管裝入血清0.5 mL以上，-40 ℃保存。

1.6 檢測(cè)方法

分別采用阻斷ELISA和間接ELISA對(duì)采集的血清樣品進(jìn)行PCV2抗體檢測(cè)。

1.6.1 阻斷ELISA抗體檢測(cè)

按試劑盒說明書進(jìn)行操作。取試劑盒置室溫，待盒內(nèi)試劑恢復(fù)到室溫，取10倍濃縮洗滌液，用蒸餾水稀釋為1倍。用血清稀釋液在稀釋板內(nèi)將待檢血清1∶1稀釋，振蕩混勻。取抗原包被板，每孔加入稀釋好的待檢血清100 μL，置37 ℃孵育2 h。甩掉抗原包被板孔中的溶液，每孔加入200～300 μL洗滌液，靜置1 min，倒掉洗滌液，重復(fù)洗板5次，吸水紙拍干抗原包被板。每孔加入100 μL酶標(biāo)鼠單抗工作液，置37℃孵育30 min，洗滌液洗板5次，方法同上。加TMB底物液，100 μL/孔，室溫或37℃避光顯色10～15 min，至陰性對(duì)照顯藍(lán)色，陽性對(duì)照基本不顯色時(shí)，每孔加終止液50 μL。在酶標(biāo)儀上讀取樣品OD450的光密度值。當(dāng)陰性對(duì)照OD450值>0.8、陽性對(duì)照OD450值<0.4時(shí)，試驗(yàn)條件成立。計(jì)算等電點(diǎn)(PI)值：PI值=(陰性對(duì)照OD450均值-待檢樣品OD450值)/陰性對(duì)照OD450均值。

結(jié)果判定：PI值≥38%判為陽性，PI值≤30%判為陰性，30%

1.6.2 間接ELISA抗體試劑盒檢測(cè)

按試劑盒說明書進(jìn)行操作。待試劑盒內(nèi)的試劑恢復(fù)到室溫，取20倍濃縮洗滌液(血清稀釋液)，用蒸餾水稀釋為1倍。用血清稀釋液在稀釋板內(nèi)將待檢血清1∶400稀釋(100 μL樣品稀釋液中加0.25 μL待檢血清)，振蕩混勻。取抗原包被板，每孔加入100 μL稀釋好的待檢血清，37 ℃孵育30 min。洗板后每孔加入山羊抗豬IgG酶標(biāo)二抗工作液100 μL，置37 ℃孵育30 min，洗滌液洗板。等體積混合顯色液A液、顯色液B液，混勻，100 μL/孔，室溫避光顯色10 min；每孔加終止液50 μL，在酶標(biāo)儀上讀取樣品OD450的光密度值。計(jì)算S/P值：

S/P值=(待檢樣本OD450均值-陰性對(duì)照OD450均值)/(強(qiáng)陽性對(duì)照OD450均值-陰性對(duì)照OD450均值)。

結(jié)果判定：S/P值≥0.25判為陽性，S/P值≤0.16判為陰性，0.16

2 結(jié)果

2.1 PCV2人工感染豬血清抗體水平

由圖1和圖2可見，PCV2攻毒組和PCV2攻毒后佐劑KHL刺激組試驗(yàn)豬，用兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果基本一致，PCV2抗體均于接種后2～3周出現(xiàn)，6～8周達(dá)到最高，直至第16周仍維持較高水平；PCV2攻毒后佐劑刺激組試驗(yàn)豬產(chǎn)生的抗體水平明顯高于PCV2攻毒組。

圖2 間接ELISA檢測(cè)PCV2人工感染豬抗體

圖1 阻斷ELISA檢測(cè)PCV2人工感染豬抗體

2.2 PMWS豬群中亞臨床感染豬和發(fā)病豬血清抗體水平

由圖3和圖4可見，用阻斷ELISA試劑盒和間接ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致，發(fā)病豬抗體陽性率為99%，亞臨床感染豬抗體陽性率為95%，PMWS豬群發(fā)病豬PCV2抗體高于亞臨床感染豬。

圖3 阻斷ELISA檢測(cè)PMWS豬群中亞臨床感染豬與發(fā)病豬PCV2抗體

圖4 間接ELISA檢測(cè)PMWS豬群中亞臨床感染豬與發(fā)病豬PCV2抗體

3 討論

目前，用于檢測(cè)PCV2抗體的方法主要是間接免疫熒光法(IFA)和ELISA法。ELISA法主要包括阻斷ELISA和間接ELISA。Walker等[4]以PCV2的細(xì)胞培養(yǎng)物為包被抗原，PCV2特異性單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)試劑，首次建立了用于檢測(cè)PCV2抗體的阻斷ELISA方法，使用該方法與IFA對(duì)豬群的484份血清以及PCV2人工感染豬血清連續(xù)抗體檢測(cè)結(jié)果證明，阻斷ELISA的敏感性和特異性都比較高，與IFA僅存在微小差異，但ELISA操作較IFA簡(jiǎn)單，更適合于在大規(guī)模場(chǎng)開展監(jiān)測(cè)。控制PCV2感染的最常用和最有效的策略是接種疫苗，通過疫苗接種引發(fā)的抗體主要針對(duì)PCV2 Cap蛋白，它是病毒的唯一且高度免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白[5]。間接ELISA由于血清樣品的成分復(fù)雜(例如類風(fēng)濕因子)，易和其他動(dòng)物血清成分的特異性抗體作用而導(dǎo)致假陽性率較高。與間接ELISA相比，應(yīng)用重組Cap蛋白單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)試劑的阻斷ELISA具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能有效反映豬群感染狀況或疫苗效力[5]。由此分析，本研究使用的阻斷ELISA抗體檢測(cè)法可能具有更廣泛的應(yīng)用前景。

兩種試劑盒對(duì)PCV2攻毒后佐劑KHL刺激組試驗(yàn)豬抗體消長(zhǎng)規(guī)律的檢測(cè)結(jié)果均顯示，PCV2攻毒后，佐劑KHL刺激組試驗(yàn)豬產(chǎn)生的抗體水平明顯高于PCV2攻毒組。KHL是一種具有高度免疫原性的大分子蛋白，已證實(shí)KHL能增強(qiáng)PCV2在豬體內(nèi)的復(fù)制、加重感染豬PMWS的臨床體征[6-7]。由此分析，PCV2攻毒后使用KHL刺激試驗(yàn)豬，可提高PCV2在豬體內(nèi)的復(fù)制，從而提高了抗體產(chǎn)生量。

PCV2單獨(dú)感染一般只能引起試驗(yàn)豬輕度至中度病變，不易復(fù)制出PMWS的明顯病癥[8-9]，往往需要其他致病因子的共同參與才能促使PMWS發(fā)生[8，10]。但PCV2感染量的多少是決定著PMWS發(fā)生的主要原因，PMWS發(fā)生往往需要一定水平PCV2的感染量[11-12]。本次檢測(cè)的PMWS發(fā)病豬場(chǎng)，發(fā)病豬陽性率為99%，亞臨床感染豬陽性率為95%，表明在PMWS發(fā)病豬場(chǎng)中，感染發(fā)病豬和亞臨床癥狀豬均感染了PCV2。PMWS豬群發(fā)病豬PCV2抗體高于亞臨床感染豬，推測(cè)感染發(fā)病豬的PCV2量高于亞臨床感染豬。個(gè)別亞臨床感染豬PCV2抗體較高但未發(fā)生PMWS，可能取決于其他致病因子參與和個(gè)體仔豬的免疫力狀況。由此分析，通過ELISA對(duì)豬群PCV2抗體監(jiān)測(cè)，不僅能有效反映豬群PCV2感染狀況或疫苗效力，也能通過PCV2抗體異常增高結(jié)合發(fā)病豬的臨床表現(xiàn)反映PMWS發(fā)生狀況。

綜上，本次使用的阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(試制)和間接ELISA抗體試劑盒不僅能有效反映豬群PCV2感染狀況或疫苗效力，也能通過PCV2抗體異常增高并結(jié)合發(fā)病豬的臨床表現(xiàn)及時(shí)發(fā)現(xiàn)PMWS的發(fā)生。阻斷ELISA抗體檢測(cè)法較間接ELISA法可能具有更廣泛的應(yīng)用前景。