孫秋艷，林婷婷，杜燕，李叢叢，夏慶祥，李舫*

(1. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東省畜禽抗菌藥物使用減量化工程技術(shù)研究中心，山東 濰坊 261061;2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

家禽養(yǎng)殖業(yè)中，養(yǎng)殖場內(nèi)環(huán)境的控制是最重要的環(huán)節(jié)，細(xì)菌可形成微生物氣溶膠。許多病原微生物可通過微生物氣溶膠進(jìn)行傳播[1-2]，因此控制微生物氣溶膠傳播的常用方法就是消毒[3-4]。但是不同的消毒模式對消毒效果影響較大，理想的消毒模式具有較好的殺死病原微生物的能力，能有效保持雞場的環(huán)境衛(wèi)生。當(dāng)今我國肉雞養(yǎng)殖籠養(yǎng)模式非常多，有標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)模式，也有地面平養(yǎng)模式和網(wǎng)上平養(yǎng)模式改成籠養(yǎng)模式的。本研究采用FA-3型氣溶膠粒度分布采樣器，對山東標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)、網(wǎng)上平養(yǎng)和地面平養(yǎng)改建籠養(yǎng)的肉雞場，其空舍期消毒前后進(jìn)行空氣細(xì)菌采樣。應(yīng)用Illumina HiSeq PE250雙末端測序法[5-6]，對細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行測序，使用Qiime軟件對細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，探討不同籠養(yǎng)模式的優(yōu)缺點(diǎn)，分析空舍期消毒劑的有效性，以形成指導(dǎo)家禽生產(chǎn)的籠養(yǎng)模式的生物安全技術(shù)規(guī)程。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

FA-3型(是型號)氣溶膠粒度分布采樣器、玻璃纖維濾膜為遼陽市康潔儀器研究所產(chǎn)品。

1.2 雞舍情況

分別在山東濰坊諸城(Z)、安丘(A)、昌邑(X)各選取一個(gè)籠養(yǎng)肉雞場進(jìn)行采樣，養(yǎng)殖模式均為3層立體籠養(yǎng)，其中雞場X是標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)雞場， Z雞場是地面平養(yǎng)改建，A雞場是地面網(wǎng)養(yǎng)改建。采樣時(shí)室外溫度均為24～29 ℃，濕度均為55%～70%。

1.3 消毒模式

第1次消毒：清水沖洗后，1∶500戊二醛癸甲溴銨消毒液噴灑消毒雞舍。

第2次消毒：固體甲醛2 g/ m3舍熏蒸消毒12 h，然后再密閉12 h；第3次消毒：0.5%戊二醛噴灑消毒。

1.4 樣品采集

樣品采集用3點(diǎn)采樣法。采樣位置分別為舍內(nèi)對角線中心中點(diǎn)、離對角線中心中點(diǎn)12 m 等距的2 個(gè)點(diǎn)(見圖1)。在距地面1.2 m處，用FA-3型氣溶膠粒度分布采樣器(氣流速度28.3 L/min，驅(qū)動(dòng)時(shí)間1 h)，采集空舍期消毒前和消毒后的樣品，雞糞清理沖洗完作為消毒前樣品數(shù)據(jù)，消毒后72 h采樣作為消毒后樣品數(shù)據(jù)。因此諸城(Z)雞場消毒前為Z1，消毒后為Z2；安丘(A)雞場消毒前為A1，消毒后為A2；昌邑(X)雞場消毒前為X1，消毒后為X2。樣品采集時(shí)，采樣人員與雞場工作人員均遠(yuǎn)離采樣器。將3個(gè)采樣點(diǎn)的8層吸附有樣品的玻璃纖維濾膜混在一起裝入無菌封口聚乙烯袋中，做好標(biāo)記，0 ℃帶回實(shí)驗(yàn)室，冷凍備用。

圖1 3個(gè)舍的采樣點(diǎn)位置

1.5 DNA提取與測序

將不同時(shí)間采集的8層玻璃纖維濾膜，用PBS作為溶解液進(jìn)行合并溶解后作為一個(gè)樣本。濃縮含有微生物的溶解液，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，提取的樣本DNA送至北京諾禾致源科技有限公司，應(yīng)用Illumina HiSeq PE250雙末端測序法，對細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)(341F～806R)進(jìn)行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

對Illumina測序的序列進(jìn)行拼接、過濾、質(zhì)控、剔除嵌合體，最終得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。用Uparse軟件，對所有樣品在97%相似度下的有效數(shù)據(jù)聚類并作為分類操作單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，分析統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用Qiime軟件計(jì)算樣品的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、譜系多樣性指數(shù)(Phylogenetic diversity，PD)、指數(shù)的Alpha多樣性(Alpha Diversity)值[7]，進(jìn)行Beta多樣性(Beta Diversity)組間差異分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品測序結(jié)果

對籠養(yǎng)肉雞舍空舍期空氣中細(xì)菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)(341F～806R)進(jìn)行測序，序列信息見表1。從OUT的個(gè)數(shù)可以看出，雞場Z、A、X 的OTUs消毒后均比消毒前有所降低。消毒效果最好的是X雞場，其次是A雞場，最后是Z雞場。

表1 樣本的序列信息

2.2 細(xì)菌群落的α多樣性分析

2.2.1 取樣深度驗(yàn)證

稀釋曲線(Rarefaction Curve)是以隨機(jī)抽取的序列數(shù)據(jù)為橫坐標(biāo)，序列對應(yīng)OTUs的數(shù)目為縱坐標(biāo)構(gòu)建的曲線，可直接反映測序數(shù)據(jù)量是否合理，還可間接反映樣品中物種的豐富程度。6個(gè)樣品的稀釋曲線如圖2所示，曲線已趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸接近合理，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息，再增大數(shù)據(jù)量對新物種的發(fā)現(xiàn)貢獻(xiàn)很小，因此，此次測序的結(jié)果可代表樣品的真實(shí)情況。

圖2 6個(gè)樣品的稀釋曲線

2.2.2 細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)分析

α多樣性指數(shù)分析是通過Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指數(shù)，對單個(gè)樣品中物種多樣性的分析。其中，Shannon指數(shù)是指綜合物種豐度和物種均勻度兩方面因素的多樣性指數(shù)，其值越大表明樣品中物種的多樣性越高；Simpson指數(shù)體現(xiàn)樣品中物種豐度指數(shù)，其值越大表明樣品中物種的多樣性越高；PD指數(shù)反映了物種組成的系統(tǒng)進(jìn)化特征的多樣性，其值越大則表示樣品中物種越豐富；Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)樣品中物種豐富度，其值越大則表示樣品中物種越多；取樣覆蓋率則反映了測序結(jié)果是否覆蓋了樣本物種數(shù)。由表2可以看出，Z雞場消毒后Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指數(shù)均大于消毒前，說明消毒后細(xì)菌種類反而增多；A雞場和X雞場消毒后Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指數(shù)均小于消毒前，但X雞場α多樣性指數(shù)降低比較大。

表2 樣品的α多樣性指數(shù)

2.2.3 細(xì)菌群落多樣性的花瓣圖

圖3直觀展示了6個(gè)樣品共有6個(gè)相同的OTUs，表明消毒劑對這6個(gè)物種作用不大，消毒后A雞場OTUs數(shù)量減少，X雞場OTUs數(shù)量顯著減少，僅剩1種，Z雞場消毒后OTUs數(shù)量反而增多，表明空舍期消毒效果較好的是X雞場，其次是A雞場。

花瓣圖中每個(gè)花瓣代表一個(gè)樣品，不同的顏色代表不同的樣品，中間的core數(shù)字代表的是所有樣品共有的OTUs數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣品特有的OTUs數(shù)目圖3 6個(gè)樣本的花瓣圖

2.3 細(xì)菌群落的Beta多樣性分析

基于非加權(quán)法(unweighted unifrac)和加權(quán)法(weighted unifrac)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis， PCoA)來研究Beta多樣性，研究結(jié)果見圖4。3個(gè)雞場消毒前和消毒后細(xì)菌群落組成差異較大，多樣性具有明顯區(qū)分，從圖4中可以看出，X雞場消毒前和消毒后細(xì)菌群落組成差異最大，其次是A雞場，最后是Z雞場。

圖4 Beta多樣性的PCoA分析

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平細(xì)菌組成分析

各樣品在門分類水平上細(xì)菌組成分析見圖5。6個(gè)樣品共得到16種細(xì)菌類群，變形菌門(Proteobacteria)不論是在消毒前還是在消毒后均是優(yōu)勢菌群，相對豐度87.4%～99.3%，其次是厚壁菌門(Firmicutes)，相對豐度0.33%～17.9%，然后是擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對豐度0.1%～8.1%，其他門含量較低。由圖5表明，X雞場消毒后細(xì)菌門水平上種類非常少，A雞場消毒后細(xì)菌種類也相應(yīng)減少，Z雞場消毒后細(xì)菌種類反而增多。

圖5 門水平細(xì)菌組成分析

2.4.2 屬水平細(xì)菌組成分析

各樣品在屬分類水平上細(xì)菌組成分析見圖6。6個(gè)樣品共得到95種細(xì)菌類群，葉桿菌屬(Phyllobacterium)除A雞場消毒前外均是優(yōu)勢菌群，其次是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和勞爾斯菌屬(Ralstonia)。由圖6表明，A雞場消毒前優(yōu)勢菌群消毒后完全消失，X雞場消毒后細(xì)菌屬水平上種類非常少，A雞場消毒后細(xì)菌種類也相應(yīng)減少，Z雞場消毒后細(xì)菌種類反而增多。

圖6 屬水平細(xì)菌組成分析

2.5 細(xì)菌豐度聚類分析

為研究消毒前和消毒后禽舍空氣中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，根據(jù)所有樣品在屬水平的豐度信息，選取豐度排名前35的屬，從物種和樣品兩個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖，結(jié)果見圖7。3個(gè)雞舍中，消毒前相對豐度最高的菌群，在消毒劑處理后明顯降低，尤其是X雞場消毒后，熱圖中未出現(xiàn)紅色方塊，表明消毒后舍內(nèi)細(xì)菌的含量非常低。但是Z雞場消毒后出現(xiàn)大面積的紅色方塊，說明Z雞場消毒后某些細(xì)菌種類開始增多。

縱向?yàn)闃悠沸畔ⅲ瑱M向?yàn)槲锓N注釋信息；熱圖對應(yīng)的值為每一行物種相對豐度經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的Z值，即一個(gè)樣品在某個(gè)分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標(biāo)準(zhǔn)差所得到的值。顏色越紅表明豐度越高圖7 微生物聚類熱圖

3 討論

孫秋艷等[8-9]通過傳統(tǒng)的自然沉降法、FA-1型六級篩孔撞擊式空氣微生物采樣器等方法對空氣中微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，存在工作量大、自然界微生物培養(yǎng)有限等問題，導(dǎo)致只能檢測到部分微生物或特定病原微生物，在種類和數(shù)量的分析上存在很大局限性[10]。Illumina HiSeq PE250雙末端測序法成功解決了通量低、準(zhǔn)確率低、操作復(fù)雜等問題，與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法相比，能夠檢測到更多的微生物基因信息，更加全面、準(zhǔn)確地闡明微生物群落結(jié)構(gòu)特征[11-12]。

X雞場是標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)雞場，具有自動(dòng)清糞設(shè)備，自動(dòng)混合通風(fēng)，具有數(shù)控裝備，隨時(shí)監(jiān)控舍內(nèi)溫度、濕度等功能，雞舍規(guī)格110 m×13.5 m×3.5 m，舍內(nèi)地面光滑；Z雞場是地面平養(yǎng)改建的，人工清糞，縱向負(fù)壓通風(fēng)(仍然是老的通風(fēng)設(shè)備)，無數(shù)控裝備，雞舍規(guī)格110 m×14 m×3.5 m，舍內(nèi)地面凹凸不平；A雞場是地面網(wǎng)養(yǎng)改建，人工清糞，縱向負(fù)壓通風(fēng)，無數(shù)控裝備，雞舍規(guī)格120 m×14 m×3.5 m，舍內(nèi)地面光滑。α多樣性指數(shù)和花瓣圖分析可以看出，Z雞場消毒后細(xì)菌種類反而增多，A雞場和X雞場消毒后空氣中細(xì)菌種類相對于消毒前明顯減少，可能由于Z雞場消毒后，舍內(nèi)地面凹凸不平，消毒后殘留水分較多，有利于微生物滋生，且通風(fēng)效果不好?？梢?，空氣中細(xì)菌種類與通風(fēng)設(shè)施、通風(fēng)時(shí)間、舍內(nèi)地面及時(shí)干燥等因素有關(guān)。細(xì)菌豐度聚類結(jié)果表明，空舍期消毒后，雞舍中相對豐度最高的菌群，在消毒后明顯降低，由此表明，籠養(yǎng)雞舍空舍期消毒具有一定效果。

Beta多樣性是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。細(xì)菌群落的PCoA分析結(jié)果表明，3個(gè)雞場消毒前和消毒后群落組成差異較大，多樣性具有明顯區(qū)分，表明消毒具有一定效果。

3個(gè)雞舍均位于山東濰坊，養(yǎng)殖模式均為3層立體籠養(yǎng)，采樣時(shí)間均為2018年4至5月份，采樣時(shí)室外溫度均為24～29 ℃，濕度均為55%～70%，因此，3個(gè)雞舍所處的環(huán)境條件相差不大。通過細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，在門水平上，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為三大優(yōu)勢菌群，其中變形菌門的豐度最高；在屬分類水平上，A雞場消毒前優(yōu)勢菌群在消毒后完全消失，消毒后3個(gè)雞場優(yōu)勢菌群為葉桿菌屬(Phyllobacterium)，其次是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和勞爾斯菌屬(Ralstonia)，因此飼養(yǎng)模式對消毒后致病菌種類沒有影響。不論消毒前還是消毒后，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)豐度都較高，可引起動(dòng)物呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、傷口及皮膚感染和泌尿生殖道感染等。不動(dòng)桿菌屬在消毒前后空氣樣本中一直存在，由此說明，3個(gè)雞舍消毒后檢測到致病菌與環(huán)境沒有關(guān)系，空舍期消毒可能對其作用不大。所以，建立籠養(yǎng)肉雞場科學(xué)有效的生物安全體系就顯得尤為重要。