李家宬陳殿寧顧正彪,2李才明,2李兆豐,2

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

直鏈麥芽低聚糖是指由3～10個葡萄糖單元以α-1,4-糖苷鍵連接而成的寡糖聚合體，具有甜度較低、保濕能力強、吸濕性小等特點，在改善食品質地、風味及延長面包、速凍食品保質期方面具有良好的應用效果[1-2]；此外，直鏈麥芽低聚糖還具有良好的生理功能，可在不引起血糖急劇升高的情況下，緩慢持續(xù)地為人體供能，是最具潛力的新型低聚糖之一[1]。其中，聚合度3～6的直鏈麥芽低聚糖(G3～G6)具有適中的黏度，可作為磷酸寡糖合成的前體，促使人體對Ca2+的吸收[3]，還可以抑制腸道腐敗菌生長，促進益生菌增殖，維護腸道健康[4-5]，因此，具有更好的應用前景。

直鏈麥芽低聚糖的工業(yè)化生產主要采用酶法工藝，即通過麥芽糖生成酶(EC 3.2.1.1)作用淀粉而成[6]。其酶解產物中不僅含有G3～G6，還含有單、雙糖和六糖以上的組分，產物中G3～G6所占比例不高，限制了其工業(yè)化應用。目前鮮有直鏈麥芽低聚糖分離純化的報道，但市場上存在兩種產品形式：① 以“mg”為訂購單位的高純度純品，用于儀器分析，價格昂貴；② 純度較低的直鏈麥芽低聚糖糖漿，并未實現(xiàn)高純度樣品的大批量、連續(xù)化生產，因而限制了其研究與應用。

課題組[7]前期已成功構建來源于BacillusstearothermophilusSTB04的直鏈麥芽低聚糖生成酶(Bst-MFA酶，GenBank: AIV43245.1)的BacillussubtilisWB600表達系統(tǒng)，并研究了該酶制備直鏈麥芽低聚糖的情況。結果顯示，該酶生產的直鏈麥芽低聚糖主要為G5和G6，G3～G6所占比例也相對較高。試驗擬以該酶酶解產物為原料，探究膜分離、活性炭吸附分離、葡聚糖凝膠柱層析分離和離子交換樹脂柱層析分離等技術對直鏈麥芽低聚糖組分的影響，以G3～G6、G5+G6比例和回收率為指標，綜合評判各技術對直鏈麥芽低聚糖各組分的分離能力，并分析了相關機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米淀粉：山東大宗生物開發(fā)股份有限公司；

普魯蘭酶：2 000 U/mL，日本天野公司；

G3～G7標準品：上海惠誠生物科技有限公司；

葡聚糖凝膠G-25：西寶生物科技(上海)股份有限公司；

鈉型、鈣型離子交換樹脂：天津南開大學樹脂有限公司；

鉀型K310離子交換樹脂：陶氏化學(羅門哈斯)中國有限公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高效陰離子交換色譜儀(HPAEC-PAD)：CS-5000 plus型，美國Thermo Scientific有限公司；

管式陶瓷膜超濾設備：CeraMen-0100型，廈門福美科技有限公司；

阿貝折射儀：WAY-2S型，上海始恒儀器設備有限公司；

電導率儀：STARTER3100C型，奧豪斯國際貿易(上海)有限公司；

順序式模擬移動床：小試設備-1型，上海兆光色譜分離技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米淀粉的酶解 配制質量分數(shù)為45%的玉米淀粉乳，調節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，按底物干基加入Bst-MFA酶20 U/g，以2.0 ℃/min的速率升溫至90 ℃，保溫30 min，以10 ℃/min的速率將溫度降為65 ℃，穩(wěn)定后加入普魯蘭酶20 U/g，反應24 h。

1.2.2 直鏈麥芽低聚糖的組分分析 取1 mL樣品，沸水浴30 min滅酶[8]、定容、離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過0.22 μm水系濾膜，稀釋一定倍數(shù)后用HPAEC-PAD分析產物組成[9]。

HPAEC-PAD分析參照文獻[7]的方法。分別按式(1)、(2)計算G1～G7(G1、G2分別表示葡萄糖、麥芽糖，其他組分由于缺乏相應的標準品，未做定量分析)的產率和G1～G7中各糖組分的比例。

(1)

(2)

式中：

Y——目標產物的產率，%；

c1——稀釋后樣品中目標產物的濃度，mg/mL；

m1——取樣質量，mg；

ω——目標產物的比例，%；

c——樣品中G1～G7的濃度，mg/mL。

1.2.3 直鏈麥芽低聚糖濃度的測定 采用阿貝折射儀[10]。

1.2.4 酶解產物的預處理 酶解產物經滅酶、離心后保留上清液，在最佳溫度和活性炭負載量下，進行活性炭脫色處理[11]。此外，為避免待分離樣品中的金屬離子置換出離子交換樹脂上的功能離子，脫色樣品需依次泵入陰、陽離子交換樹脂柱以去除雜離子[12]，水洗流速230 mL/min，上樣流速140 mL/min，待有糖液流出時開始收集。經此處理的樣品，電導率在10 μS/cm以下時可用于后續(xù)分離[13]。

1.2.5 直鏈麥芽低聚糖的分離純化

(1) 膜分離：依次用陶瓷膜、有機膜[14]對酶解液中的直鏈麥芽低聚糖進行分離純化，每進行一次膜分離均收集透過液和截留液，并用HPAEC-PAD分析直鏈麥芽低聚糖的組成變化。以分離前后樣品中目標產物的增量和回收率為評價指標，并按式(3)、(4)進行計算。

(3)

(4)

式中：

Δ——目標組分比例的增量，%；

ω1——初始酶解液中目標組分的比例，%；

ω2——分離后樣品中目標組分的比例，%；

γ——目標組分的回收率，%；

σ1——初始酶解液的糖度，%；

σ2——分離后樣品的糖度，%。

(2) 活性炭吸附分離：參照文獻[15]并做適當修改。層析柱尺寸為Φ1 cm×90 cm，上樣量為1 mL。用超純水洗脫G1，再分別用體積分數(shù)為5%，7%，10%的乙醇溶液洗脫G2、G3和G4，最后用15%的乙醇溶液洗脫其他糖，洗脫流速1.0 mL/min，自動部分收集器每管收集4 mL洗脫液，采用阿貝折射儀測定洗脫液中的糖濃度，并用HPAEC-PAD分析洗脫液中直鏈麥芽低聚糖的組成變化。

(3) 葡聚糖凝膠柱層析分離：參照文獻[16]并做適當修改。操作溫度為60 ℃，洗脫劑為超純水，洗脫流速為1.0 mL/min，自動部分收集器每管收集4 mL洗脫液，分析洗脫液中直鏈麥芽低聚糖的組成變化。

(4) 離子交換樹脂柱層析分離：參照文獻[17]并做適當修改。操作溫度為60 ℃，洗脫劑為超純水，用恒流泵控制流速，自動部分收集器每管收集4 mL洗脫液，分析洗脫液中直鏈麥芽低聚糖的組成變化。將鈉型樹脂轉化為鈣型的方法為：鈉型樹脂溶脹后先用1 mol/L的鹽酸溶液浸泡24 h，用去離子水洗至中性，再用1 mol/L的CaCl2溶液將其轉化為鈣型，最后用去離子水洗至無Ca2+流出。鉀型樹脂用去離子水浸泡溶脹24 h即可使用。

(5) 模擬移動床分離：將樣品糖濃度濃縮至50%，順序式模擬移動床操作條件為填料總體積8 L，12根尺寸為Φ3.9 cm×65 cm的分離柱，操作溫度60 ℃，洗脫劑為去離子水，進樣流速19.5 mL/min，進水及循環(huán)流速39 mL/min，通過調整模擬移動床的閥切換時間控制目標產物的組成。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 試驗結果為3次獨立試驗的平均值，用平均值和標準偏差表示。采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 酶解產物分析

按照1.2.1所示方法制備直鏈麥芽低聚糖，并對產物組分進行分析。結果顯示，復合使用Bst-MFA酶和普魯蘭酶作用于質量濃度45%的玉米淀粉乳24 h后，所得產物中含有大量的麥芽低聚糖，其中G1～G7的產率為85.89%。G5+G6的總質量占G1～G7總質量的55.46%，G3～G6占G1～G7的比例達到77.08%，產物中G3～G6、G5+G6的比例還有待進一步提高。

2.2 膜分離效果分析

以5 nm陶瓷膜和1 000 Da的有機膜組合對酶解液中的直鏈麥芽低聚糖進行分離純化。酶解液經5 nm陶瓷膜過濾處理，以除去大分子顆粒；將透過液用1 000 Da的有機膜進行二次分離，以除去G1～G4等小分子糖。

膜分離對G5+G6和G3～G6的分離效果見表1。結果顯示，相比于初始酶解液，透過液中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了14.07%和8.04%，表明膜分離可以在一定程度上分離直鏈麥芽低聚糖。但G5+G6和G3～G6的回收率低于60%，大量目標產物損失于膜分離的過程中，且G5+G6和G3～G6所占比例還未達到較高水平。這可能是因為膜分離技術主要通過分子量大小和顆粒形狀對產物進行分離，而不同的直鏈麥芽低聚糖分子量差異較小，且為鏈狀結構，相比于球狀分子更難利用膜分離的方式進行分離。

2.3 活性炭吸附分離效果分析

活性炭具有較大的表面積，其內、外表面和孔隙均可吸附直鏈麥芽低聚糖分子，當用去離子水洗脫時，G1首先脫吸附，依次增加洗脫劑中乙醇的濃度，G2～G7可相繼被洗脫[15]。試驗結果顯示，相比于初始酶解液，分離產物中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了23.52%和0.91%(表1)。然而，G5+G6和G3～G6的回收率均低于50%，可能是因為活性炭對G1～G7的吸附能力過強，使得洗脫劑不能將被吸附的糖完全洗脫回收。

2.4 葡聚糖凝膠柱層析分離效果分析

葡聚糖凝膠可通過分子篩原理對直鏈麥芽低聚糖進行分離純化，其對G5+G6和G3～G6的分離效果見表1。相比于初始酶解液，分離產物中G5+G6和G3～G6所占比例分別達到84.43%和86.09%，分離效果優(yōu)于膜分離和活性炭吸附分離。

表1 直鏈麥芽低聚糖不同分離純化方法對比?

葡聚糖凝膠可比較高效地分離不同組分的直鏈麥芽低聚糖，可能是由于當直鏈麥芽低聚糖流經葡聚糖凝膠層析柱時，分子量較大、鏈長較長的G5～G7只能在凝膠顆粒的網孔外移動，流速較快因而先從凝膠層析柱中流出；分子量較小的組分(如G1和G2)可以進入凝膠顆粒內部，流速較慢而后從層析柱中流出。流速差異使得不同組分流經色譜柱的時間不同，從而實現(xiàn)G1～G7中不同組分的高效分離。但葡聚糖凝膠成本較高，黏度和密度均較大的糖漿在分離過程中易產生較高的柱壓，使部分凝膠的糖苷鍵水解或交聯(lián)結構受損[18]，分離效果下降。

2.5 離子交換樹脂柱層析分離效果分析

2.5.1 鈉型離子交換樹脂柱層析分離 鈉型離子交換樹脂的可交換離子為Na+，其對G5+G6和G3～G6的分離效果見表1，相比于初始酶解液，分離產物中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了2.76%和2.10%，但回收率均低于20%，可見鈉型離子交換樹脂柱對目標產物的分離效果不明顯。

2.5.2 鈣型離子交換樹脂柱層析分離 參照1.2.5(4)方法將鈉型離子交換樹脂轉為鈣型，其對G5+G6和G3～G6的分離效果見表1，相比初始酶解液，分離產物中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了36.07%和10.85%，回收率分別為63.52%和51.48%，可見，鈣型離子交換樹脂柱對目標產物的分離效果優(yōu)于鈉型。這可能是因為雖然二者分離直鏈麥芽低聚糖主要基于Na+和Ca2+與糖分子所帶羥基間的配位絡合交換原理，但Ca2+與糖分子所帶羥基的絡合作用強于Na+。

2.5.3 鉀型離子交換樹脂柱層析分離 鉀型K310樹脂層析柱是以分子體積排阻作用為主導對直鏈麥芽低聚糖進行分離純化，其分離效果見表1。當上樣體積為1 mL，洗脫劑流速為1.0 mL/min時，與初始酶解液相比，分離產物中G5+G6和G3～G6的比例分別升高至77.38%和83.35%，回收率分別高達78.11%和63.89%，分離效果優(yōu)于鈉型和鈣型樹脂。這可能是因為鈉型和鈣型兩種樹脂孔隙較大，粒徑分布不均且交聯(lián)度較低，G1～G7均可通過孔隙，分子體積排阻效應未得到很好的體現(xiàn)。而鉀型K310樹脂的孔徑介于G4和G5之間，G1～G7通過樹脂時被分成兩部分，G1～G4隨洗脫劑在樹脂孔徑內移動，而G5～G7通過層析柱時只能隨洗脫劑在孔徑外(樹脂顆粒間)移動，流出色譜柱的時間差異使得G1～G4和G5～G7得以分離。鉀型樹脂柱的分離原理類似于葡聚糖凝膠柱，可見分離直鏈麥芽低聚糖時應使分子體積排阻發(fā)揮主導作用。

2.6 順序式模擬移動床分離

對比上述幾種直鏈麥芽低聚糖的分離方法，選用鉀型K310樹脂為吸附劑填料對目標產物進行分離純化。參照1.2.5(5)方法設置模擬移動床條件，周期時長是指連續(xù)分離過程中一個分離周期(從進樣到下一次進樣)的時間。測定不同周期時長下所收集樣品中的目標產物含量，發(fā)現(xiàn)隨著周期時長的縮短，提余液中G3～G6的比例和回收率均逐漸降低，G5+G6的比例和回收率先升高后降低。當周期時長為1 378 s時，G5+G6的比例和回收率均達到最高，分別為84.74%和84.23%(表2)，此時直鏈麥芽低聚糖分離前后的HPAEC-PAD色譜圖如圖1所示，分離效果較好。

表2 模擬移動床分離純化直鏈麥芽低聚糖?

從模擬移動床的分離過程來解釋，待分離原料F從串聯(lián)色譜柱的中部加入色譜柱系統(tǒng)，分離過程中洗脫劑D從左端進入并自左向右流動，色譜柱向左移動。提取液A中各組分(G1～G4)在色譜柱中的移動速度較慢，從串聯(lián)色譜柱左端收集，而提余液B中各組分(G5～G7)移動速度較快，從色譜柱右端收集。要實現(xiàn)兩組分分離，色譜柱系統(tǒng)閥切換速度需介于A和B在色譜柱中的移動速度之間。隨著閥切換時間的縮短，色譜柱向左移動的速度越來越快，直鏈麥芽低聚糖分子更多地隨色譜柱向左移動，提余液自B處流出要經歷的色譜柱長度增加，使得G5～G7與G1～G4分離得更為徹底，而G1～G4在提取液A處被收集的作用也更加明顯，這時，在B處收集的提余液中G5+G6的比例和回收率升高而G3～G6的比例和回收率略有下降；然而，若閥切換時間進一步縮短，G5～G7隨色譜柱向左移動的速度越來越快也會在A處被部分收集，導致提余液B中G5+G6的比例和回收率有所降低，G3～G6的比例和回收率進一步降低。當模擬移動床的分離周期為1 378 s時，提余液中G3～G6比例和回收率均較高，且G5+G6達到最高的比例和回收率，通過噴霧干燥可制備含高比例G5+G6的直鏈麥芽低聚糖固體粉末。

G1. 葡萄糖 G2. 麥芽糖 G3. 直鏈麥芽三糖 G4. 直鏈麥芽四糖 G5. 直鏈麥芽五糖 G6. 直鏈麥芽六糖 G7. 直鏈麥芽七糖

3 結論

采用多種手段對直鏈麥芽低聚糖生成酶的酶解產物進行分離純化。結果顯示，基于選擇透過性原理的膜分離技術對不同分子量的直鏈麥芽低聚糖分離效果不佳，目標產物的比例及回收率均較低；活性炭對低聚糖的吸附能力過強，導致目標產物回收率低且耗時耗能；基于分子篩原理的葡聚糖凝膠柱層析分離效果較好，但其在分離過程中易產生過高的柱壓，不利于連續(xù)化批量操作；不同離子類型的離子交換樹脂對直鏈麥芽低聚糖的分離效果不同，其中，基于配位絡合交換原理的鈉型與鈣型樹脂對G5+G6的純化效果并不理想，而主要依靠分子體積排阻效應的鉀型K310樹脂對G3～G6和G5+G6的分離效果較好。在此基礎上，以鉀型K310離子交換樹脂為固定相吸附劑，采用模擬移動床對直鏈麥芽低聚糖進行連續(xù)分離純化，通過優(yōu)化模擬移動床的分離周期，可將G3～G6和G5+G6所占比例進一步提高。