趙倩如，朱麗英，趙權(quán)宇，江 凌

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

近年來,過敏性疾病的發(fā)病率不斷增加，食物過敏已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。牛乳過敏(CMA)是一種最常出現(xiàn)的食物過敏反應(yīng)[1]，占所有確診食物過敏病例的9%[2]，嬰兒牛乳過敏發(fā)病率從0.3%到7.5%不等[3]。牛乳過敏是由牛乳中的致敏蛋白引起的一種不良反應(yīng)，主要由免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可引起過敏性鼻炎、哮喘、濕疹、腹瀉、胃腸出血等癥狀，甚至?xí)?dǎo)致過敏性休克，嚴(yán)重危及嬰幼兒的生命[4]。牛乳中最具有營養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)是乳清蛋白，乳清蛋白中主要的致敏蛋白是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

目前檢測(cè)乳品中過敏原的方法主要有3種：高效液相色譜法(HPLC)、電泳法、免疫化學(xué)法。最常見的蛋白電泳方法是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[5-7]和毛細(xì)管電泳法[8]以及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[9-10]通過抗原抗體特異性結(jié)合可以測(cè)定過敏原的免疫反應(yīng)性(與免疫球蛋白結(jié)合的能力)。但以上方法在測(cè)定β-乳球蛋白時(shí)都具有一定的局限性,如電泳技術(shù)在定量方面有很大的不足；毛細(xì)管電泳重復(fù)性差，容易堵塞；ELISA方法對(duì)試劑的選擇性高。牛乳中蛋白質(zhì)種類很多，很難有效檢測(cè)，以上技術(shù)局限性限制了這些方法在實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。反相高效液相色譜法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一，與其他檢測(cè)方法相比具有分辨率和回收率高、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。反相高效液相色譜法可以高效實(shí)現(xiàn)大分子以及復(fù)雜物質(zhì)快速分離，對(duì)乳品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行定性定量檢測(cè)[11]。定量檢測(cè)技術(shù)為開發(fā)市場(chǎng)中低過敏乳制品的質(zhì)量提供了有效方法。另外，如何通過改性技術(shù)降低牛乳致敏性開發(fā)低致敏乳品[12]也成為研究的熱點(diǎn)。

在食品加工過程中，主要采用的降敏方法有3種：物理[13]、化學(xué)[14]和生物學(xué)[15]方法。酶降解致敏蛋白[16-18]是最常見的一種方法，通過酶將大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽以被吸收利用，可以降低過敏蛋白的致敏性。沈小琴等[19]研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶是最常用來水解牛乳中致敏蛋白的酶。

本研究中，筆者擬建立一種高效液相色譜技術(shù)定量檢測(cè)乳清蛋白中主要致敏蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的方法，同時(shí)評(píng)測(cè)該檢測(cè)方法的可行性，選擇胰蛋白酶作為酶解代表試劑處理乳清蛋白中的致敏蛋白，采用可視化優(yōu)化方法預(yù)測(cè)最佳的酶解處理?xiàng)l件[20]，以期為低致敏乳品的開發(fā)提供有效的檢測(cè)方法和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥85%)、β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥90%)、酪蛋白、分離乳清蛋白，上海源葉生物科技有限公司；三氟乙酸(色譜純)、乙酸(分析純)，美國 TEDIA 公司；乙腈(色譜純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶，南京都萊生物技術(shù)有限公司；蒙牛牛奶、伊利嬰兒配方奶粉，當(dāng)?shù)爻小悠芳熬幪?hào)為1#，α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；2#，β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；3#，分離乳清蛋白；4#，蒙牛牛奶；5#，伊利嬰兒配方奶粉。

1.2 主要儀器

DSHZ-300A型旋轉(zhuǎn)式恒溫水浴振蕩器，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；GA88-Ⅱ型超聲破碎儀，無錫上佳生物科技有限公司；UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀色譜儀,Dionex公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；GZX-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；GTL100型恒溫金屬浴，北京萊普特科學(xué)儀器有限公司。

1.3 主要溶液及配制

醋酸緩沖液。3.86 g冰醋酸和2.93 g無水醋酸鈉加入蒸餾水定容至1 L。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別準(zhǔn)確稱量α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，加入2 mL蒸餾水進(jìn)行溶解，配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋成質(zhì)量濃度為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液。準(zhǔn)確稱量樣品，加入蒸餾水定容至100 mL，待測(cè)。牛奶按照文獻(xiàn)[21]優(yōu)化的方法進(jìn)行處理，將新鮮的牛奶以5 000g轉(zhuǎn)速低溫冷凍離心20 min去脂肪，去脂肪上清液和醋酸緩沖液等體積混合，以8 000g離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.4 檢測(cè)條件

1.4.1 高效液相色譜條件

流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，檢測(cè)溫度為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫條件具體見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 流動(dòng)相及相關(guān)溶液前處理

1)流動(dòng)相A、B以及洗脫液配制完成后需要在簡(jiǎn)易抽濾裝置下進(jìn)行去除雜質(zhì)；

2)流動(dòng)相在進(jìn)行抽濾過后進(jìn)行超聲，20 ℃條件下超聲30 min以去除氣泡；

3)樣品以及標(biāo)品溶液在上樣之前用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾處理。

1.4.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1)樣品中的蛋白含量X的計(jì)算見式(1)。

(1)

式中：X為試樣中的蛋白含量，以100 g樣品計(jì)算；C為蛋白的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為試樣的實(shí)際稀釋液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2)利用外推法求得樣品分析方法的檢出限，分別取3種低濃度樣品平行測(cè)定3次，求出每種濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用線性回歸法做出擬合曲線，擬合曲線相交于y軸的點(diǎn)，為S0，則3S0為樣品分析方法的檢出限。

3)分別進(jìn)行樣品分析方法的精密度、穩(wěn)定性以及樣品回收率的探究，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，取數(shù)據(jù)的平均值作為檢測(cè)結(jié)果。

1.5 胰蛋白酶降解

1.5.1 樣品預(yù)處理

將樣品4#(市售的牛乳)進(jìn)行脫脂，將脫脂牛乳加熱至85 ℃，維持10 min以使得蛋白充分變性，調(diào)節(jié)恒溫混勻儀至水解溫度，以600 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行充分混合水解，水解結(jié)束后加熱至120 ℃使酶失活。改變酶解溫度、時(shí)間、酶量，多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 智能可視化軟件優(yōu)化

采用可視化優(yōu)化方法對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行分析處理，預(yù)測(cè)出最佳的酶解工藝條件。首先確定酶解條件的區(qū)間，酶解條件作為多維空間中的向量，再利用映射模型將多維空間中的簡(jiǎn)單數(shù)據(jù)映射到二維平面，在該平面中自動(dòng)生成目標(biāo)函數(shù)或輪廓的輪廓。根據(jù)輪廓的分布直觀地定位優(yōu)化的操作方向或區(qū)域，最后在該區(qū)域中找到接近最優(yōu)的點(diǎn)，可以用反演映射方法映射回原始的多維空間，預(yù)測(cè)出最優(yōu)酶解條件[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜法測(cè)定方法相關(guān)結(jié)果

相比于C4柱，選用常見且分離效果更佳的C8柱對(duì)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行分離，以280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，目標(biāo)物出峰時(shí)間短，分離效果好。圖1為1 mg/mL的α-乳白蛋白和2 mg/mLβ-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。由圖1可知，這兩種蛋白的分離峰形尖銳、分離度較好。其中，α-乳白蛋白在12.1 min出峰，β-乳球蛋白在14.5 min出峰，β-乳球蛋白出現(xiàn)雙峰。根據(jù)Brownlow等[23]報(bào)道，β-乳球蛋白隨著pH變化會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，通常它是以二聚體的形式存在，當(dāng)pH低于3.5或高于7.5時(shí)，二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化，形成膨脹的單體。

圖1 α-乳白蛋白標(biāo)樣和β-乳球蛋白標(biāo)樣譜圖

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系

根據(jù)配制的一系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度，分別繪制α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)所得曲線進(jìn)行線性回歸分析，具體的線性方程和數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

表2 蛋白線性方程及檢出限

由表2可知，對(duì)于2種致敏蛋白，所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.125～2.000 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明線性關(guān)系良好。這種外標(biāo)法可以快速定量分析樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白濃度。

2.2.2 定量限(LOQ)和檢出限(LOD)

定量限結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生所需精密度和準(zhǔn)確度的定量α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別為0.062 5和0.080 0 mg/mL。換算成樣品(以每100 g試樣計(jì)算)中的含量α-乳白蛋白為0.03 g，β-乳球蛋白為0.02 g。α-乳白蛋白定量限達(dá)到食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)(DBS 32/011—2016)為0.03 g，β-乳球蛋白定量限略高于團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)(T/TDSTIA 007—2019)為0.018 g。

儀器檢出限結(jié)果顯示α-乳白蛋白為0.090 0 mg/mL和β-乳球蛋白為0.100 0 mg/mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白檢出限分別為0.078 0和0.090 0 mg/mL。

2.2.3 精密度

精密度是保證準(zhǔn)確度的先決條件。為了進(jìn)行此次精密度探究，利用α-乳白蛋白和β-乳球蛋白3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見表3。由表3可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%，說明該方法對(duì)蛋白質(zhì)具有測(cè)量的再現(xiàn)性。

表3 蛋白質(zhì)檢測(cè)精密度數(shù)據(jù)

2.2.4 特異性

以樣品3#為代表進(jìn)行特異性探究，分別對(duì)未處理和經(jīng)過處理的樣品溶液進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，經(jīng)過處理后的2種蛋白的色譜峰峰形尖銳，分離效果好，說明該分析方法對(duì)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白具有特異性。

圖2 不同條件下的色譜圖

2.2.5 穩(wěn)定性研究

將配制好的5種樣品的新鮮溶液和經(jīng)過48 h冷藏后的儲(chǔ)備溶液平行測(cè)定3次，研究分析方法的穩(wěn)定性，結(jié)果如表4所示。由表4可知，經(jīng)過48 h后的冷藏儲(chǔ)備液并沒有明顯的降解，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%，說明該方法能在48 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)蛋白含量的穩(wěn)定定量測(cè)定。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別取樣品4#和樣品5#各1 mL，每份樣品中等體積加入標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(0.2 mg/mL的α-乳白蛋白溶液和0.4 mg/mL的β-乳球蛋白等體積混合)，如前所述進(jìn)行蛋白含量分析，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果如表5所示。由表5可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%，回收率在92%～96%，表明該方法可以實(shí)現(xiàn)樣品較高的回收率。

表5 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.2.7 不同樣品中致敏蛋白含量測(cè)定

利用該色譜分析方法分別對(duì)樣品3#、4#和5#進(jìn)行了2種致敏蛋白的含量測(cè)定，具體結(jié)果如表6所示。由表6可知，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)不同乳品中致敏蛋白含量的檢測(cè)。值得注意的是樣品5#(嬰兒配方奶粉)中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量較低，說明嬰兒配方奶粉中的致敏蛋白含量已經(jīng)受到控制，不同乳制品中致敏蛋白含量也有所差異，牛乳比嬰幼兒配方奶粉中β-乳球蛋白含量要高，會(huì)更容易出現(xiàn)過敏現(xiàn)象。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果

2.3 胰蛋白酶水解

相比于一些物理化學(xué)降解方法，酶降解是一個(gè)溫和有效的過程，研究表明胰蛋白酶可以有效地降解致敏蛋白，首先設(shè)計(jì)單因素變量法考察酶降解影響因素(溫度、酶量、水解時(shí)間)，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，取數(shù)據(jù)的平均值作為測(cè)定結(jié)果，其次進(jìn)行正交試驗(yàn)，最后利用可視化方法預(yù)測(cè)出最佳的酶解條件。

2.3.1 單因素變量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 溫度對(duì)酶解效果的影響

選取樣品4#作為水解底物，將牛乳按照之前所述進(jìn)行處理，分成15份作為水解底物，水解底物為1 mL脫脂牛乳。另外，脫脂牛乳保留1份作為原液進(jìn)行測(cè)定。將胰蛋白酶配制成1 g/L的酶溶液，按照高酶量6 000 U/g胰蛋白酶加入到樣品溶液中，按照之前所述方法進(jìn)行水解，水解時(shí)間設(shè)為30 min，溫度梯度設(shè)置為25、35、40、45和50 ℃，最后測(cè)得水解底物中剩余致敏蛋白濃度。具體結(jié)果表7所示。由表7可知，胰蛋白酶在一定的酶量和酶解時(shí)間下，在40 ℃水解條件下最佳，溫度過高或者過低水解效果均不佳。因此，在40 ℃左右分別取2個(gè)溫度作為酶解溫度的最佳區(qū)間(35、40和45 ℃)，作為溫度因素的3個(gè)水平。

表7 不同溫度下的酶解結(jié)果

2.3.1.2 酶量對(duì)酶解效果的影響

根據(jù)溫度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在40 ℃條件下按照各酶量加到樣品溶液中水解，30 min后測(cè)定水解底物中剩余致敏蛋白濃度，具體結(jié)果如表8所示。由表8可知，在一定水解溫度和水解時(shí)間條件下，酶量與水解效果成正比，但是當(dāng)超過6 000 U/g胰蛋白酶時(shí)，水解效果下降不再明顯。為了保證牛乳中營養(yǎng)成分的同時(shí)降低致敏蛋白的含量，本研究以接近母乳中蛋白含量為標(biāo)準(zhǔn)，使用1 000、1 500和2 000 U/g胰蛋白酶為酶量的3個(gè)水平。

表8 不同酶量下的酶解結(jié)果

2.3.1.3 水解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

根據(jù)溫度、酶量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在溫度40 ℃、1 000 U/g胰蛋白酶的條件下進(jìn)行水解，水解時(shí)間為10、20、30、40和50 min，最后測(cè)得水解底物中剩余致敏蛋白濃度，具體結(jié)果如表9所示。由表9可知，隨著時(shí)間不斷延長(zhǎng)，降解效率越來越高，同樣為了保證乳制品中乳清蛋白的營養(yǎng)不被完全破壞，保持低濃度的β-乳球蛋白，選擇水解時(shí)間為20、30和40 min作為時(shí)間因素的3個(gè)水平。

表9 不同時(shí)間下的酶解結(jié)果

2.3.2 多因素變量實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，根據(jù)單因素變量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別挑選溫度、酶量、水解時(shí)間最優(yōu)區(qū)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果以剩余蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)，具體結(jié)果見表10和表11。

表10 正交試驗(yàn)結(jié)果

表11 極差分析

由表10～11結(jié)果確定了正交試驗(yàn)最優(yōu)處理?xiàng)l件：溫度40 ℃、1 500 U/g胰蛋白酶、水解時(shí)間40 min。

2.3.3 可視化方法優(yōu)化

表12 可視化優(yōu)化方法的優(yōu)化結(jié)果

圖3 胰蛋白酶降解工藝降維映射平面圖

可視化誤差分析如表13所示。由表13可知，可視化優(yōu)化方法可用于預(yù)測(cè)最優(yōu)化酶解條件。

表13 可視化優(yōu)化方法誤差分析

2.3.4 最優(yōu)酶降解條件

根據(jù)正交試驗(yàn)和可視化方法得到的酶解最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組進(jìn)行3次行平行測(cè)定，結(jié)果如表14所示。預(yù)測(cè)胰蛋白酶水解的最佳條件為溫度45 ℃、2 000 U/g胰蛋白酶、水解30 min。由表14可知，在此條件下水解率已達(dá)到較高值，且致敏蛋白在蛋白質(zhì)中比例接近母乳(23%)說明營養(yǎng)沒有被破壞，此條件可作為胰蛋白酶水解的最佳條件。

表14 最佳條件酶解

3 結(jié)論

利用反相高效液相色譜法采用Sepax-C8色譜柱對(duì)乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)分析，并且評(píng)測(cè)了該方法的可行性，在該方法下樣品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白出峰時(shí)間短，分離效果好。同時(shí)進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性和回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果RSD均小于5%，也證實(shí)了方法的可行性。利用胰蛋白酶降解致敏蛋白，采用智能可視化優(yōu)化方法預(yù)測(cè)最優(yōu)酶解條件，結(jié)果表明在45 ℃下加入2 000 U/g胰蛋白酶水解30 min后，2種致敏蛋白含量占總蛋白的22.7%，大大降低了乳品中的致敏蛋白含量。本次研究可為乳制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)及生產(chǎn)低致敏乳品提供依據(jù)。