王 睿，辛家祥，楊仲麗，王艷玲，胡凱瑞，黃海龍，徐 敏

(華東師范大學(xué) 物理與電子科學(xué)學(xué)院 上海市磁共振重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062)

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民生活水平的不斷提升，人們對(duì)食品安全也有了更高的要求。由于SO2、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、低亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽等含硫化合物具有漂白、防腐和抗氧化的作用，所以在食品、藥材的生產(chǎn)加工過(guò)程中，經(jīng)常用作漂白劑，抑制或破壞食品與藥材中的變色因子，避免食品褐變并延長(zhǎng)存放時(shí)間。上述物質(zhì)就是食品中無(wú)機(jī)硫的人為來(lái)源[1]，這些物質(zhì)的過(guò)量使用不僅會(huì)破壞食品和藥材的品質(zhì)[2]，還會(huì)嚴(yán)重影響消費(fèi)者的健康。如SO2及其衍生物具有腐蝕性，刺激支氣管和肺等器官，使食用者極易患上呼吸道炎癥[3]；此外，還會(huì)損害人的肝、胃以及腎等器官，甚至?xí)p害人體中的細(xì)胞遺傳物質(zhì)[4]。因此必須嚴(yán)格控制食品中無(wú)機(jī)硫的含量。

當(dāng)前常規(guī)檢測(cè)SO2的方法有滴定碘量法和比色法。如國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸副玫瑰苯胺法[5]，雖然準(zhǔn)確，但耗時(shí)長(zhǎng)，終點(diǎn)難以判定[6]，不適用于大批量檢測(cè)；比色法中試劑要求嚴(yán)格，有顏色時(shí)會(huì)產(chǎn)生干擾。較為新型的檢測(cè)SO2和亞硫酸根的方法有熒光法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法[7]和酶法，檢測(cè)負(fù)二價(jià)硫化物的方法有乙酸鉛試紙法[8]。這些方法雖然靈敏度和準(zhǔn)確度相對(duì)較高，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格相對(duì)昂貴以及操作難度大等缺點(diǎn)，操作過(guò)程中有些還涉及了四氯化汞這類毒性較大的化學(xué)試劑[9]。故對(duì)于食品中的含硫化合物的監(jiān)督和檢測(cè)，發(fā)展一種攜帶方便、操作簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量檢測(cè)的快速方法迫在眉睫[10]。

低場(chǎng)核磁共振(LF-NMR)分析儀是近年來(lái)快速發(fā)展的一種分析設(shè)備，通常采用較低成本的永磁體構(gòu)建主磁場(chǎng)，不僅設(shè)備成本低，維護(hù)、屏蔽和場(chǎng)地成本也大幅降低，使之從專業(yè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向大眾應(yīng)用成為可能。與高場(chǎng)儀器相比，低場(chǎng)儀器體積小、質(zhì)量輕，甚至可以將其攜帶至檢測(cè)地點(diǎn)，開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。同時(shí)，LF-NMR檢測(cè)技術(shù)還具有快速、無(wú)損和實(shí)時(shí)的特點(diǎn)，因此在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用正在不斷擴(kuò)大[11-13]。目前，其在食品檢測(cè)中的常見(jiàn)方法包括對(duì)縱向弛豫時(shí)間(T1)、橫向弛豫時(shí)間(T2)的檢測(cè)，并可實(shí)現(xiàn)波譜采集和成像[14]。

由于弛豫時(shí)間對(duì)原子核所處環(huán)境敏感，因此筆者考慮設(shè)計(jì)一種檢測(cè)試劑，通過(guò)含硫化合物影響檢測(cè)試劑的弛豫時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)利用LF-NMR對(duì)含硫化合物進(jìn)行檢測(cè)。基于這一思路，同時(shí)考慮到檢測(cè)試劑的穩(wěn)定和易攜帶性，筆者設(shè)計(jì)了一種水凝膠[15]作為檢測(cè)試劑。參照喬從德[16]和Tang等[17]的研究，選用水溶性良好、無(wú)毒的聚乙二醇丙烯酸酯(PEGA)[16]為基，并以2-丙烯酸-2-甲氧基乙酯(MEA)和丙烯酰胺(AM)作為共聚單體，以增強(qiáng)水凝膠的強(qiáng)度和韌性[17]，同時(shí)加入鋇鹽作為檢測(cè)劑，應(yīng)用溶液聚合法，成功得到多組分高濃度含鹽水凝膠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MEA(98%)、PEGA(Wm)=480)、重水(D2O，99.9%氘代)，美國(guó) Sigma-Aldrich公司；AM(99%)，Greagent公司；偶氮二異丁腈(AIBN，98%)、過(guò)氧化苯甲酰(BPO，75%)、BaCl2·2H2O(99%)，Adamas公司；過(guò)硫酸銨(APS，98%)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純。以上試劑未經(jīng)處理直接使用。

1.2 儀器與設(shè)備

NMRC12-010V-T型核磁共振儀(磁場(chǎng)強(qiáng)度：(0.3±0.05)T；溫控范圍：(30±0.1)℃)，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；Bruker AVANCE III 500型 NMR核磁共振波譜儀(質(zhì)子共振頻率為 500.13 MHz)，德國(guó)Bruker公司；alpha1-2型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Chirst公司。

1.3 方法

1.3.1 合成方法

1.3.1.1 PEGA-MEA-AM共聚水凝膠的合成

將3.0 g(6.25 mmol)PEGA溶于10.40 g水中，然后加入1.20 g(9.22 mmol)MEA，攪拌30 min確保單體完全溶解。之后，向溶液中加入1.20 g(16.88 mmol)AM和少量APS引發(fā)劑，并在60 ℃下攪拌反應(yīng)6 h形成凝膠。然后將所得水凝膠靜置并冷卻至室溫。

1.3.1.2 高含鹽量PEGA-MEA-AM凝膠的合成

第一步，在0.006 g(0.04 mmol)AIBN中加入1.20 g(9.22 mmol)MEA，在15 ℃避光的條件下攪拌30 min，至白色晶體完全溶解。第二步，將3.0 g(6.25 mmol)PEGA與1.40 g水中攪拌30 min確保單體完全溶解，并加入第一步的溶液中攪拌至溶解。第三步，將2.44 g(10 mmol)二水合氯化鋇在7 g水溶解之后加入第二步溶液中。最后，向2.0 g水中加入1.2 g(16.88 mmol)AM，15 ℃避光攪拌15 min至完全溶解后，加入第三步溶液中攪拌至完全溶解。將上述溶液注入模具，在70 ℃下梯度升溫反應(yīng)8 h形成凝膠。然后將所得水凝膠靜置并冷卻至室溫。部分樣品置于凍干機(jī)中凍干12 h，以得到干燥樣品。

1.3.1.3 氘代水凝膠的合成

在原操作條件和操作方法的基礎(chǔ)上，將反應(yīng)中的水改為等量的氘代水(D2O)進(jìn)行合成，可以得到對(duì)應(yīng)的氘代水凝膠。用于凝膠的NMR表征。

1.3.2 凝膠的表征

分別使用高場(chǎng)和低場(chǎng)核磁共振進(jìn)行測(cè)試。使用NMR核磁共振波譜儀對(duì)氘代凝膠樣品進(jìn)行1H NMR測(cè)試。使用核磁共振儀橫向弛豫時(shí)間T2的測(cè)試，質(zhì)子共振頻率為21.56 MHz，磁感應(yīng)強(qiáng)度0.5 T，磁體的溫度30 ℃，樣品通過(guò)加熱保持與磁體溫度相同。樣品管是直徑為10 mm的核磁管，核磁管中樣品的高度是1.5 cm左右。選擇 CPMG序列(圖1)，采樣參數(shù)如下：采樣頻率(SW)=100 kHz、重復(fù)掃描次數(shù)(NS)=16、回波個(gè)數(shù)(Echo Count)=15 000、重復(fù)采樣等待時(shí)間(TW)=5 000 ms。所得CPMG指數(shù)衰減曲線采用儀器自帶的MultiExpInv Analysis軟件進(jìn)行反演得到T2圖譜，并對(duì)各峰面積進(jìn)行積分。

圖1 測(cè)定1H T2的CPMG脈沖序列

1.3.3 食品樣品的前處理方法

1.3.4 水凝膠的弛豫時(shí)間測(cè)量

將加工處理好的凍干水凝膠置于10 mm低場(chǎng)核磁管底部，分別加入0、1、10和100 mg/kg的Na2SO4溶液1.5 mL，15 min后用低場(chǎng)核磁共振儀器，采用CPMG序列進(jìn)行1H T2測(cè)量，采集到指數(shù)衰減曲線后進(jìn)行反演，得到低場(chǎng)的T2弛豫譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEGA-MEA-AM多組分凝膠及含鹽水凝膠的合成

在不存在Ba2+的情況下，凝膠可以按照自由基聚合的機(jī)制，在水溶液中以PEGA、MEA和AM作為聚合單體，使用APS作為引發(fā)劑。3種單體的1H NMR譜圖見(jiàn)圖2。單體的相應(yīng)結(jié)構(gòu)和每個(gè)氫原子的出峰位置均標(biāo)在相應(yīng)譜圖中。由圖3可知，在δ5.5～6.5范圍內(nèi)均出現(xiàn)明顯的雙鍵峰。

圖2 聚合單體PEGA、MEA和AM的1H NMR譜圖

雖然三組分凝膠已被成功合成，但是在有較高濃度離子存在的情況下，則不能達(dá)到聚合效果，得到的凝膠極不均勻。由該現(xiàn)象推斷有兩個(gè)原因，一個(gè)原因是離子的阻聚。因?yàn)樵谳^高濃度無(wú)機(jī)金屬離子存在的情況下，離子會(huì)對(duì)引發(fā)劑產(chǎn)生影響，進(jìn)而阻聚。對(duì)此原因的驗(yàn)證，嘗試進(jìn)行降低離子濃度的操作，但較低的離子濃度仍然不能形成凝膠。第二個(gè)原因則是反應(yīng)前期APS中的過(guò)硫酸根引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生硫酸根類似結(jié)構(gòu)的初級(jí)自由基(引發(fā)歷程見(jiàn)圖3)，其與Ba2+結(jié)合而失去了引發(fā)的效果。因此，此反應(yīng)改用偶氮二異丁腈(AIBN)替代APS作為引發(fā)劑，并在較低溫度下使用較少量的引發(fā)劑，小心地避光攪拌，在后期形成凝膠時(shí)使用梯度升溫，以減少暴聚和氣泡的產(chǎn)生。引發(fā)劑和單體調(diào)整到物質(zhì)的量比為n(AIBN)∶n(MEA)∶n(PEGA)∶n(AM)=1∶ 230∶ 150∶ 420的最優(yōu)比例，既可以在聚合前完全溶解成為一個(gè)澄清的體系，又可以在合適的速率進(jìn)行聚合，得到?jīng)]有氣泡的均勻凝膠。

圖3 過(guò)硫酸銨引發(fā)聚合的初級(jí)反應(yīng)歷程

按照之前相同的操作將水替換為氘水后，利用NMR進(jìn)行了凝膠的氫譜表征，1H NMR譜圖如圖4所示，相應(yīng)的結(jié)構(gòu)也標(biāo)在譜圖中。與圖2進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)3種對(duì)應(yīng)的單體碳碳雙鍵位置δ5.5～6.5譜峰完全消失，說(shuō)明雙鍵全部參與聚合，多組分共聚水凝膠已被成功合成。

圖4 PEGA-MEA-AM水凝膠的1H NMR譜

2.2 PEGA-MEA-AM水凝膠用于快速檢測(cè)硫酸鹽

為了保證硫酸鹽濃度的準(zhǔn)確性，筆者直接采用Na2SO4水溶液進(jìn)行測(cè)試。將加工處理好的凍干水凝膠用純水和不同濃度的Na2SO4溶液浸泡，然后用低場(chǎng)核磁共振儀器，采用CPMG序列進(jìn)行1H T2測(cè)量，采集到指數(shù)衰減曲線后進(jìn)行反演，得到低場(chǎng)的T2弛豫譜，如圖5所示。

在核磁共振實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品施加一個(gè)射頻場(chǎng)，使樣品躍遷到激發(fā)態(tài)，撤去射頻場(chǎng)后，原子核會(huì)逐漸回到平衡態(tài)，這個(gè)過(guò)程就是弛豫。弛豫分為縱向弛豫和橫向弛豫，本文用到的是橫向弛豫T2。原子核的弛豫時(shí)間除了與物質(zhì)本身有關(guān)以外，還與原子核所處環(huán)境有關(guān)，因此在水凝膠內(nèi)成分改變時(shí)，可通過(guò)測(cè)量T2時(shí)間來(lái)反映物質(zhì)的內(nèi)部性質(zhì)[18]。

在水凝膠中水的含量很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)高分子鏈的含量，且高分子鏈上的1H弛豫時(shí)間很短，因此近似認(rèn)為除干凝膠的譜圖外，其他譜圖中顯示出來(lái)的為水分子的T2。從圖5譜圖中可以看出，T2主要有3個(gè)分布區(qū)域。根據(jù)水的運(yùn)動(dòng)性可以對(duì)這幾個(gè)組分進(jìn)行大致的分類[19-20]：T2在1 000～10 000 ms的組分運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)，稱之為自由水，譜圖上標(biāo)記為T(mén)21；T2小于10 ms的組分，水分子被束縛，運(yùn)動(dòng)性差，稱之為結(jié)合水，譜圖上標(biāo)記為T(mén)23；而T2在10～100 ms的組分，分子運(yùn)動(dòng)受到一定的阻礙，稱之為中間水，譜圖上標(biāo)記為T(mén)22。在本實(shí)驗(yàn)中，中間水組分對(duì)離子之間的相互作用和凝膠的限制作用比較敏感，運(yùn)動(dòng)性發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)在譜圖上就是峰形、峰寬和峰位的改變。在干凝膠中也有水分的存在，即中間水和結(jié)合水，其中，中間水含量較少，結(jié)合水含量較多。(需要指出的是，干凝膠中水分含量少，譜峰強(qiáng)度低，為了和其他樣品進(jìn)行比較，已將譜圖放大，因此譜峰的強(qiáng)度不具有定量意義。)在干凝膠中加入純水后，立即出現(xiàn)大量自由水(T21，圖5(a))，而中間水裂分成為雙峰，同時(shí)明顯向左偏移。將弛豫時(shí)間較長(zhǎng)的標(biāo)記為T(mén)22-1，在圖中用黑色箭頭標(biāo)出；弛豫時(shí)間較短的標(biāo)記為T(mén)22-2，在圖中用綠色箭頭標(biāo)出?？梢钥闯?，隨著濃度的增加，T22-1 和T22-2的峰位都向左移動(dòng)，對(duì)不同濃度Na2SO4溶液處理的凝膠體系的T22-1 和T22-2的峰位分布進(jìn)行分析(圖5(c))，可以發(fā)現(xiàn)得到相同的變化趨勢(shì)，均類似指數(shù)變化，低濃度即可引起明顯變化，隨著濃度升高變化趨緩。因此該方法對(duì)低濃度的檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)。因此，對(duì)于未知樣品，可以根據(jù)T22-1 和T22-2的位置，大致了解其硫含量的范圍，再進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖5 凝膠樣品及其在純水及不同濃度Na2SO4溶液中的T2弛豫譜(a),中間水和結(jié)合水區(qū)域放大圖(b)，T2隨Na2SO4濃度的變化(c)

基于上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，可以認(rèn)為PEGA-MEA-AM多組分凝膠有望對(duì)食品中無(wú)機(jī)硫含量進(jìn)行定量或半定量的檢測(cè)，之后再將疑似超標(biāo)的樣品進(jìn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)，即快檢與法檢的有機(jī)結(jié)合，加快檢驗(yàn)速度、降低檢測(cè)成本。尤其是前處理和核磁檢測(cè)都具有方法簡(jiǎn)單，快速的特點(diǎn)，符合食品快檢的要求。但仍需進(jìn)一步研究包括優(yōu)化凝膠組分、確定檢測(cè)限和標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)曲線等，力爭(zhēng)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。相關(guān)工作仍在進(jìn)行當(dāng)中。

3 結(jié)論

本研究中，筆者制備了一種多組分含鹽水凝膠，凍干后加工成型得到檢測(cè)試劑，通過(guò)低場(chǎng)核磁共振技術(shù)可以在0～100 mg/kg(以Na2SO4計(jì))的范圍內(nèi)定量或半定量測(cè)定總無(wú)機(jī)硫的含量，此外，本方法前處理簡(jiǎn)單無(wú)污染，符合食品快檢的要求和趨勢(shì)，有望為食品藥品含硫熏蒸或過(guò)量添加的檢測(cè)提供一種新的有效手段和方法。