諸駿杰，孫文閃，周婷婷，董葉箐，鐘寒輝，黃榮博，吳丹虹，徐子健，章 虎

(綠城農科檢測技術有限公司，浙江 杭州 310051)

草甘膦(glyphosate，GLY)是一種無選擇性除草劑，因為低毒、廉價、高效等特點廣泛運用在全世界各個農業(yè)和非農業(yè)領域，在環(huán)境和生物體內不斷富集，通過食物和水進入體內，對人體造成危害[1]。草銨膦(glufosinate,GLU)具有低毒、好吸收、高活性、殺草廣譜、環(huán)境兼容性強等特點,成為世界第二大轉基因作物耐受除草劑，通過植物蒸騰作用可以在植物木質部之間進行傳導，其速效性在百草枯和草甘膦之間[2-3]。隨著草甘膦和草銨膦使用頻率不斷上升，其殘留問題越來越受到公眾的關注，我國《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量規(guī)定》(GB 2763—2019)規(guī)定油脂中草甘膦和草銨膦限量為0.05 mg/kg，其中草銨膦為臨時限量。建立簡便、準確、可靠、靈敏、快速的植物油中可以同時測定草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid，AMPA)和草銨膦殘留的檢測方法非常重要。

目前，草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測方法有氣相色譜法(GC)[4]、離子色譜法(IC)[5-6]液相色譜法(LC)[7]、氣相色譜質譜法(GC-MS)[8]、液質聯用法(LC-MS-MS)[9-15]等。由于草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸均為強極性化合物，不溶于大部分有機溶劑，難揮發(fā)，缺少熒光和發(fā)色基團，在常規(guī)反相柱上沒有保留，難以利用氣相色譜和液相色譜進行分離，直接通過紫外、熒光、質譜檢測器進行檢測，靈敏度太低，因而需要通過衍生反應來改變在氣相和液相上的色譜行為以及提高檢測器的響應值。前處理繁瑣，衍生反應時間長，離子色譜法雖然不需要衍生，但是靈敏度低，雜質干擾嚴重。

本文中，筆者擬建立一種分散液液萃取非衍生液質聯用測定植物油中的草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的方法，樣品首先通過正己烷分散，再用乙腈水液液萃取，通過氨基色譜柱進行分離，質譜多反應監(jiān)測(MRM)測定，外標法定量，以期該法可用于植物油中草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷(色譜純)，德國CNW科技公司；乙酸銨(質譜純)，美國賽默飛世爾公司；標準品草甘膦(CAS號：1071-83-6)、氨甲基膦酸(CAS號：1066-51-9)、草銨膦(CAS號：77182-82-2)(純度>98%)，德國Dr Ehrenstofer公司。

1.2 儀器與設備

LC30A型超高效液相色譜8050型三重四級桿質譜儀(配電噴霧離子源)，日本島津公司；ACQUITY UPLC-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、ACQUITY UPLC-T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，Waters 公司；DikmaPolyamino氨基柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)，迪馬科技；ST16R型高速離心機，美國賽默飛世爾公司；EUFO-945616型渦旋振蕩器，TALBOYS公司；Milli-Q型超純水儀，美國密理博公司；BSA224S型電子天平，德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取(0.200 0±0.000 5)g食用油(精確到0.000 1 g)于10 mL聚丙烯離心管中，加入0.5 mL正己烷，2 500 r/min渦旋混合20 s，再加入0.8 mL乙腈-水(體積比1∶ 1)，2 500 r/min渦旋混合30 s，10 000 r/min離心2 min，取下層清液過0.22 μm混合膜，待上機測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為DikmaPolyamino氨基柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)、進樣量為10 μL、柱溫為30 ℃、流速為0.2 mL/min；流動相為A為乙腈，B為乙酸銨-氨水溶液(5 mmol/L乙酸銨溶液，用氨水調節(jié)pH到 12)，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫參數

1.3.3 質譜條件

采用ESI源、負離子MRM掃描模式進行質譜條件和離子源參數優(yōu)化。

1.3.4 標準溶液配制

稱取草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸標準品，用純水溶解配制成200 mg/L標準儲備液，4 ℃下保存待用。基質標準曲線的配制：采用空白樣品(山茶油、玉米油、大豆油)經分散萃取，用萃取液配制基質標樣，草銨膦為0.005～0.1 mg/L，草甘膦、氨甲基膦酸為0.01～0.2 mg/L，現用現配。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1 質譜條件的優(yōu)化

首先采用針泵流動注射連續(xù)進樣的方式進行質譜全掃描檢測，得到被測化合物的一級質譜圖，找出每個化合物對應的母離子。然后進行二級質譜掃描，得到相應的子離子。每個化合物找出兩對特征離子，分別對碰撞能量和Q1和Q3兩個四極桿的偏轉電壓優(yōu)化，得到草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的最佳質譜參數，如表2所示。最后對毛細管電壓、霧化氣流量、加熱氣流量、Heat Block溫度、DL 管溫度、Interface溫度進行優(yōu)化，得到最佳離子源參數：毛細管電壓4.0 kV，霧化氣流量3.0 L/min，加熱氣流量10.0 L/min，Heat Block溫度400 ℃，DL 管溫度250 ℃，Interface溫度300 ℃。

表2 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的質譜條件參數

2.1.2 液相條件的優(yōu)化

比較ACQUITY UPLC-C18柱、ACQUITY UPLC-T3柱和DikmaPolyamino氨基柱對草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的分離效果，流動相采用乙腈-乙酸銨-氨水溶液，結果如圖1所示。由圖1可知，C18柱和T3柱上沒有保留，峰型不好，有拖尾現象，因此C18柱和T3柱對草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸沒有分離作用。氨基柱在糖類等碳水化合物分析廣泛應用，于是用它來分析，草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸在DikmaPolyamino氨基柱分離效果好，峰型尖銳對稱。

圖1 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸在不同色譜柱上的色譜圖

比較乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨-氨水溶液3種流動相體系，結果如圖2所示。由圖2可知，乙腈-乙酸銨-氨水溶液作為流動相，草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的峰型最好。經過優(yōu)化得到最佳的液相條件：DikmaPolyamino氨基色譜柱，流動相為pH=12的5 mmol/L乙酸銨-氨水溶液和乙腈梯度洗脫(洗脫程序見表1)。

圖2 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸在不同流動相上的色譜圖

2.1.3 前處理條件優(yōu)化

2.1.3.1 分散劑的選擇

理想的分散劑滿足兩個條件：①對樣品具有很好的溶解性，②對萃取劑和目標物不相溶。筆者比較了丙酮、異丙醇和正己烷作為分散劑對植物油提取效果的影響。結果顯示，當正己烷作為分散劑時，加入乙腈-水溶液離心后得到明顯的分層(結果未顯示)。因此，選擇正己烷作為分散劑。在保持萃取劑體積相同的情況下，考察分散劑體積分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL對提取效率的影響，結果如表3所示。

表3 分散劑體積對提取效率的影響

由表3可知：目標物的提取率隨分散劑體積的增加而升高，0.5 mL以后達到穩(wěn)定，0.9 mL以后略微下降，于是選擇分散劑體積為0.5 mL。

2.1.3.2 萃取劑的選擇

當分散劑確定以后，萃取劑對目標物的提取效率起著非常重要的作用，萃取劑既要與目標物有較好的溶解性，又要和分散劑不相溶。筆者將乙腈、甲醇和水按一定比例混合作為萃取劑進行了比較。結果表明，當使用乙腈-水(體積比1∶ 1)混合溶液作為萃取劑的提取效果最好，這可能是由于混合后溶劑極性的改變和流動相相似性共同導致的。因此，最終以乙腈-水(體積比1∶ 1)混合溶液作為萃取劑。當萃取劑為乙腈-水(體積比1∶ 1)混合溶液時，考察萃取劑體積分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL對提取效果的影響，結果如表4所示。由表4可知，隨著萃取劑體積的增加，提取效率不斷增加，當萃取劑體積增加到0.8 mL以后，提取率無明顯提高?？紤]到稀釋倍數的問題，于是選擇萃取劑體積為0.8 mL。

表4 萃取劑體積對提取效率影響

2.1.3.3 萃取時間的選擇

萃取時間對目標化合物的提取效率有著不可忽視的影響，在萃取劑和分散劑保持一定的條件下，考察不同的萃取時間(10、20、30、40、50和60 s)對提取率的影響，結果見表5。由表5可知，當萃取時間在30s以后，提取率達到穩(wěn)定，所以選擇30 s作為最佳萃取時間。

表5 萃取時間對提取率的影響

2.2 方法學考察

2.2.1 方法的檢出限、定量限、線性范圍

通過空白樣品不斷降低添加草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸標準溶液的濃度來確定檢出限(LOD)，當達到3倍信噪比(S/N)時對應的加標濃度分別為0.01、0.02和0.02 mg/kg。通過空白樣品不斷降低添加標準溶液的濃度來確定定量下限(LOQ)，當達到10倍信噪比(S/N)且回收率大于等于70%時對應的加標量分別為0.02、0.04和0.04 mg/kg。利用玉米油，大豆油和山茶油空白基質配制的草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸標準曲線在0.005～0.1、0.01～0.2、0.01～0.2 mg/L范圍內有良好的線性關系，基質標準曲線線性方程和相關系數見表6。

表6 不同基質標準曲線線性方程、相關系數

2.2.2 方法的準確度與精密度

方法的準確度通過空白樣品添加回收實驗的回收率來考察，精密度通過同一濃度平行添加6次回收率的相對標準偏差(RSD)來獲得，分別以玉米油，大豆油和山茶油為對象進行回收試驗，加標水平分別為1倍、5倍和10倍定量限，每個水平平行試驗6次，結果如表7所示。由表7可知：平均回收率為73.2%～89.6%，精密度RSD值為4.86%～9.24%,符合GB/T27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范基本信息食品理化檢測》中的回收率和精密度的要求。

表7 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的回收率和精密度(n=6)

2.3 實際樣品檢測

運用上述方法對市場上隨機采購的30份食用植物油進行測定，其中花生油7份，大豆油6份，芝麻油3份，玉米油5份，山茶油6份，葵花油3份。草甘膦和草銨膦檢出樣品分別為3份(2份大豆油和1份山茶油)和1份(山茶油)，含量分別為0.043、0.053、0.106和0.064 mg/kg。與標準方法(GB 23200.108—2018，SN/T 1923—2007)相比，該方法簡單、快速準確。

3 結論

建立了分散液液萃取非衍生-超高效液相色譜-串聯質譜快速檢測植物油脂中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的方法，采用正己烷作為分散劑，乙腈-水作為萃取劑，萃取分層后進樣氨基色譜柱進行分離，MRM監(jiān)測，基質外標法定量。該方法前處理簡單，有機溶劑消耗量小，樣品無需使用酸堿試劑調節(jié)pH，無需衍生，快速準確,可用于食用植物油中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸快速測定，具有一定的推廣價值。