吳岳琴，王 珍，彭醒醒，章 虎，陸 雯

(綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310052)

微生物采樣涉及各個(gè)領(lǐng)域，如食品、餐飲、醫(yī)療等方面，而物體表面微生物采樣更是其中極重要的一個(gè)方面[1-2]。GB 14934—2016食(飲)具消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及大腸菌群為餐飲具檢測(cè)指標(biāo)。目前的表面微生物采樣主要是借助拭子擦拭待檢物表面，再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌回收率的高低是一個(gè)由多因素相互作用的過程，受拭子材質(zhì)、取樣方法、洗脫方式等因素的影響[3]。然而，現(xiàn)有市場(chǎng)上的拭子材質(zhì)種類繁多，拭子采樣轉(zhuǎn)移過程可能會(huì)導(dǎo)致較大的微生物計(jì)數(shù)誤差[4]。此外，不同材質(zhì)的拭子及不同的洗脫方式對(duì)物體表面微生物的回收率有較大的影響[5]。拭子材質(zhì)中常見的有植絨、海綿和棉簽等，其中植絨拭子是由尼龍短纖維絨毛頭和ABS塑料桿構(gòu)成的一種一次性采樣拭子，在病毒和DNA等采集方面，已有研究發(fā)現(xiàn)植絨拭子表現(xiàn)出較好的吸附和釋放能力[6-8]，而未見對(duì)植絨、海綿和棉簽這3種材質(zhì)的驗(yàn)證比較報(bào)道。因此，如何選擇性價(jià)比高的拭子材質(zhì)以及合適的洗脫方式來提高表面微生物采樣效率成為關(guān)鍵。本文中，筆者以這3種拭子為對(duì)象研究評(píng)估拭子材質(zhì)與洗脫方式對(duì)表面微生物收集效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium，CMCC(B)50115)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 6538)，南京便診生物科技有限公司；不銹鋼板(規(guī)格6 cm×6 cm)、不同材質(zhì)的拭子(植絨拭子、海綿拭子和棉簽拭子)。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，青島海博生物公司；0.85%無菌NaCl溶液，自制。

精密移液器，Eppendorf中國(guó)有限公司；HFSafe-1200TE型生物安全柜，力康生物醫(yī)療科技股份有限公司；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器公司；WG-2XJ型細(xì)菌濁度儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司；HTY-302型微生物限度檢驗(yàn)儀，杭州泰林生物技術(shù)股份有限公司；Lab dancer S25型漩渦振蕩器，德國(guó)IKA公司；VHX-1000 系列超景深三維顯微系統(tǒng)，日本基恩士(KEYENCE)公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 菌懸液制備

接種大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于36 ℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)物用0.85%無菌NaCl溶液適當(dāng)稀釋，通過測(cè)定菌液OD值并結(jié)合GB 4789.2—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定》方法，制成含菌量分別為1 000、500和100 CFU/mL左右的菌懸液。

1.3 洗脫方法驗(yàn)證

1.3.1 拭子接菌

用精密移液器移取250 μL上述不同含菌量的菌液分別至3種無菌干燥的拭子材質(zhì)(植絨、海綿和脫脂棉)上，注意滴加時(shí)緩慢，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)拭子，使菌液均勻分布于拭子上并使其完全吸收，不同濃度的每種菌液分別對(duì)應(yīng)以上3種材質(zhì)拭子，每組3個(gè)平行。

1.3.2 菌液洗脫

將上述染有不同濃度菌的拭子用滅菌剪刀剪去拭子與手接觸的部分，將拭子頭分別置于裝有20 mL無菌生理鹽水的試管中，分別采用人工手部振蕩100次、渦旋振蕩1 min和40 kHz超聲清洗1 min，3種不同洗脫方式洗脫后通過孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，再用20 mL無菌生理鹽水潤(rùn)洗大試管，將潤(rùn)洗液繼續(xù)抽濾，重復(fù)4次。用無菌鑷子將濾膜取出，平鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，避免濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡，進(jìn)行36 ℃、48 h培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)，具體計(jì)算見式(1)。

菌數(shù)回收率=洗脫的菌落數(shù)/制備菌落數(shù)×100%

(1)

1.4 模擬采樣后洗脫驗(yàn)證

1.4.1 不銹鋼板接種

取不銹鋼材質(zhì)的無菌板81塊，分為3組，每組27塊，吸取100 CFU/mL左右的待測(cè)菌懸液1 mL，每種供試菌懸液分別接種在1組不銹鋼板上，且接種面積為5 cm×5 cm的正方形，用無菌生理鹽水替代菌液接于不銹鋼板表面，作為陰性對(duì)照，并于層流臺(tái)下吹干待用。

1.4.2 擦拭取樣

1)實(shí)驗(yàn)組。取3種材質(zhì)拭子分別擦拭接有同種供試菌的不銹鋼板，每組3個(gè)平行。將拭子用0.85%無菌NaCl溶液浸潤(rùn)，分別以30°傾斜角來回均勻涂抹3次[3,9]。用滅菌剪刀剪去拭子與手接觸部分，將拭子頭置于裝有20 mL無菌生理鹽水的試管中。

2)對(duì)照組。分別吸取100 CFU/mL左右的大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL，分別加入至裝有20 mL無菌生理鹽水的大試管中，每組2個(gè)平行?；靹蚝螅ㄟ^孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，再用20 mL無菌生理鹽水潤(rùn)洗大試管，將潤(rùn)洗液繼續(xù)抽濾，重復(fù)4次。用無菌鑷子將濾膜取出，平鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，避免濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡，進(jìn)行36 ℃、48 h培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定

將獲取的裝有帶菌拭子的試管，分別選擇人工振蕩、渦旋和超聲3種不同洗脫方式洗脫后，通過孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，再用20 mL無菌生理鹽水潤(rùn)洗大試管，將潤(rùn)洗液繼續(xù)抽濾，重復(fù)4次。用無菌鑷子將濾膜取出，平鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，避免濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡，進(jìn)行36 ℃、48 h培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)。

拭子細(xì)菌回收率(DRR)的計(jì)算見式(2)。

(2)

1.5 顯微鏡樣品觀察

將3種材質(zhì)的棉簽頭取下，置于200倍超景深顯微鏡下觀察構(gòu)造及形態(tài)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用2016版Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗脫方式對(duì)細(xì)菌回收率的影響

對(duì)不同拭子材質(zhì)在人工振蕩、渦旋及超聲波這3種不同洗脫條件下收集的菌進(jìn)行培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，并根據(jù)式(1)計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～3。

表1 植絨拭子在不同洗脫方式下的細(xì)菌回收情況

表2 海綿拭子在不同洗脫方式下的細(xì)菌回收情況

表3 棉簽拭子在不同洗脫方式下的細(xì)菌回收情況

由表1～3可知，在負(fù)荷一定試驗(yàn)菌后的不同材質(zhì)經(jīng)不同方式洗脫，3種材質(zhì)結(jié)合3種洗脫方式回收率均達(dá)到70%以上，3種洗脫方式均符合驗(yàn)證要求[10]。其中，渦旋振蕩和超聲洗脫回收率均高于人工振蕩洗脫回收率。同時(shí)，由表1～3可以發(fā)現(xiàn)，植絨拭子取樣后，這3種方法來洗脫，洗脫后不同試驗(yàn)細(xì)菌的回收率都超過87%，遠(yuǎn)高于海綿和脫脂棉這2種拭子取樣的效果。由此可知，植絨拭子是最佳的采集拭子。

2.2 模擬采樣后不同材質(zhì)拭子洗脫方式對(duì)細(xì)菌回收率的影響

通過采用大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌人工接種至不銹鋼板，分別用不同材質(zhì)拭子模擬采樣過程，結(jié)果見表4。

表4 模擬采樣后不同拭子材質(zhì)在不同洗脫方式下的細(xì)菌收集情況

由表4可知，3種洗脫方式對(duì)供試菌的回收率為50%～85%，對(duì)于3種材質(zhì)的拭子，同一種供試菌進(jìn)行試驗(yàn)后，不同洗脫方式對(duì)細(xì)菌回收率的效果從小到大為振蕩洗脫、旋渦洗脫、超聲洗脫，即通過人工振蕩洗脫方式得到的回收率明顯低于旋渦洗脫和超聲洗脫，超聲洗脫方式與旋渦洗脫方式的效果接近。但是人工振蕩洗脫雖然簡(jiǎn)單方便，但是受人的力度及頻次影響，很難達(dá)到滿意的洗脫效果。超聲洗脫儀體積較龐大，需要及時(shí)更換無菌水，無菌操作較繁瑣。而漩渦振蕩器體積較小、操作便捷、易清潔，所以是相對(duì)優(yōu)選的洗脫方式。

2.3 拭子材質(zhì)對(duì)細(xì)菌回收率的影響

通過對(duì)3種材質(zhì)分別負(fù)荷相同菌量，并經(jīng)過洗脫收集，發(fā)現(xiàn)不同拭子材質(zhì)對(duì)細(xì)菌的收集能力不同。在同一種洗脫方式下，3種不同拭子材質(zhì)對(duì)回收同一種供試菌能力不相同，其中植絨材質(zhì)的拭子的回收率明顯高于其他2種材質(zhì)的拭子。通過超景深顯微鏡200倍鏡下觀察3種拭子結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖1。

由圖1可以發(fā)現(xiàn)：①植絨拭子頭結(jié)構(gòu)為整齊的尼龍短纖維束；②海綿拭子頭結(jié)構(gòu)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；③棉簽拭子頭結(jié)構(gòu)為雜亂的絲狀。在這3種材質(zhì)中，植絨拭子是由尼龍短纖維絨毛頭和ABS塑料桿構(gòu)成的一種一次性采樣拭子，尼龍纖維束之間的毛細(xì)管作用促進(jìn)液體樣品的強(qiáng)液壓吸收，樣品保持在表面，使洗脫更容易，海綿拭子由層層網(wǎng)狀棉絲構(gòu)成，樣品進(jìn)入內(nèi)層網(wǎng)后較難釋放，而傳統(tǒng)的棉拭子，收集的大部分樣品仍然被捕獲在頭部的纖維基質(zhì)中，不容易釋放或釋放量小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相較其他2種材質(zhì)拭子，植絨拭子能達(dá)到最大限度的收集能力及釋放能力。

圖1 3種材質(zhì)在超景深顯微鏡200倍鏡下的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

綜上所述，用植絨拭子采樣后經(jīng)漩渦振蕩1 min，可獲得最佳的微生物洗脫效果，可作為醫(yī)療器具及餐具等表面微生物安全監(jiān)控的采樣技術(shù)參考，確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。