李 爽，熊金恩，文湘郡，李 壹，盧一辰，熊 雄，劉元建，熊曉輝

(南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800)

汞離子(Hg2+)對哺乳動物細胞具有高毒性[1-4]，作為不可生物降解的持久性污染物，其可以長期保留在生態(tài)系統(tǒng)中[5-7]。近年來，越來越多的生物熒光傳感器[8-9]、納米材料熒光傳感器[10]和化學熒光探針[11-14]被開發(fā)出來用于汞離子的檢測，它們具有操作簡便、靈敏度高、選擇性強、檢測時間短等優(yōu)點。但是，這些傳感器不適用于目標物的富集、分離和去除，并且難以回收利用。因此，經(jīng)濟、環(huán)保的固相熒光傳感器的設(shè)計與合成已成為當前研究熱點。它們通常由兩部分組成：①固相載體；②包含識別基團、連接臂和發(fā)光基團的小分子熒光探針。

羅丹明是一種熒光染料，具有熒光量子效率高和吸收系數(shù)大的特點[15-17]，而且可作為識別Hg2+的熒光探針，其作用原理：當沒有Hg2+時，羅丹明B內(nèi)酰胺以閉環(huán)形式存在且不發(fā)熒光；當加入Hg2+后酰胺鍵斷裂，結(jié)構(gòu)開環(huán)，熒光強度顯著增強，從而實現(xiàn)選擇性識別Hg2+。因此其可作為檢測Hg2+的理想探針[18-20]。另外，聚苯乙烯微球具有比表面積大、性能穩(wěn)定以及吸收和表面反應(yīng)能力強等優(yōu)點，已廣泛用于色譜分離、酶固定和生物傳感器中[21-23]。在筆者之前的工作中，開發(fā)了一種基于羅丹明的聚苯乙烯熒光傳感器Ⅰ，其對Hg2+的測定檢測限低0.439 μmol/L[24]。它具有很高的靈敏度和選擇性，同時獲得了良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可用于檢測實際樣品中的Hg2+。但是，就像大多數(shù)基于羅丹明的傳感器一樣，Hg2+與其他金屬離子(例如Cu2+、Pb2+和Cd2+)之間也存在競爭性選擇性[25-26]，這在某種程度上影響了其應(yīng)用效果。

芘和萘是多環(huán)芳烴(PAHs)的兩個出色代表，具有強大而穩(wěn)定的光化學性能。作為形成折疊和π-堆疊構(gòu)象的最有效的熒光團，它們通常用于分子傳感。特別是，芘單體和準分子的熒光發(fā)射可產(chǎn)生更大的斯托克斯位移(>60 nm)，比其他任何熒光團都要好[27-28]。因此，可以通過控制單體和準分子的轉(zhuǎn)化率來設(shè)計比率型熒光探針，以實現(xiàn)金屬離子的識別。本文中，筆者在繼續(xù)對檢測限較低的新型聚苯乙烯固相熒光傳感器進行研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)了2種新型羅丹明-PAHs傳感器PS-RB-2和PS-R6G-2，其中氯甲基聚苯乙烯微球為載體，芘或萘為熒光團，用于檢測Hg2+；同時對它們的結(jié)構(gòu)-熒光關(guān)系進行探討，并且將其與筆者先前報道的傳感器Ⅰ[24]進行比較，基于晶體結(jié)構(gòu)從理論層面探討檢測機制。值得關(guān)注的是，筆者不僅將PS-RB-2用于實際樣品中Hg2+的測定，而且還將其開發(fā)用于固相萃取柱，通過觀察明顯的顏色變化快速檢測Hg2+。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

采用四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標，在CDCl3溶劑中使用BrukerAV-400型光譜儀進行核磁共振(NMR)檢測。使用Thermo Nicolet 380型紅外光譜分析儀(FT-IR)，用KBr壓片法記錄紅外(IR)光譜。在Thermo TSQ Quantum Access MAX質(zhì)譜儀上進行質(zhì)譜分析。元素分析使用FlashEA-1112型元素分析儀。在Shimadzu RF-5301PC型熒光光譜儀上，使用直徑為1 cm的比色皿在室溫下進行熒光光譜分析，狹縫寬度設(shè)置為5 nm。除另有說明外，所有試劑均來自南京晚晴化玻儀器有限公司。Ca2+、Na+、K+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Cd2+、Fe2+、Cr3+和Ba2+從各自氯化物或硝酸鹽中獲得。

1.2 合成化合物RB-1和R6G-1

參照文獻[29]合成了化合物RB-1，根據(jù)文獻[30]的方法制備化合物R6G-1。

1.3 化合物RB-2和R6G-2的合成

在N2保護下將化合物RB-1或R6G-1(1 mmol)和1-芘甲醛或1-萘甲醛(1 mmol)溶解在乙醇(100 mL)中，然后將混合物回流24 h。通過硅膠色譜柱層析(AcOEt/石油醚，體積比1∶ 4)對粗產(chǎn)物進行過濾純化，得到黃色固體RB-2(0.48 g，產(chǎn)率72%)或R6G-2(0.43 g，產(chǎn)率75%)。

(E)-3′,6′-雙(二乙氨基)-2-((吡啶-1基亞甲基)氨基)螺[異吲哚啉-1,9′-黃嘌呤]-3-1(RB-2)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)：δ9.60(s，1H，CH)，δ8.52(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，δ8.11(m，9H，ArH)，δ7.53(m，2H，ArH)，δ7.20(d，J=6.8 Hz，1H，ArH)，δ6.64(d，J=8.8 Hz，2H，ArH)，δ6.55(d，J=2.4 Hz，2H，ArH)，δ6.28(q，J=2.4 Hz，2H，ArH)，δ3.32(q，J=7.0Hz，8H，CH2)，δ1.14(t，12H，J=7.0Hz，CH3)。

ESI-MS分析。C45H40N4O2的計算值[M+H]+為669.32，實測值為669.33。對于C45H40N4O2：C 80.81，H 6.03，N 8.38；實測值為C 80.55，H 6.06，N 8.43。

(E)-3′,6′-雙(乙基氨基)-2′，7′-二甲基-2-((萘-1-基亞甲基)氨基)螺[異吲哚啉-1,9′-黃嘌呤]-3-1(R6G-2)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)：δ9.36(s，1H，CH)，δ8.03(q，J=1.6 Hz，2H，ArH)，δ7.88(d，J=6.8 Hz，1H，ArH)，δ7.77(t，J=1.6 Hz，2H，ArH)，δ7.50(m，2H，ArH)，δ7.40(m，3H，ArH)，δ7.17(t，J=1.6 Hz，1H，ArH)，δ6.54(s，2H，ArH)，δ6.26(s，2H，ArH)，δ3.31(q，J=7.2 Hz，4H，CH2)，δ1.82(s，6H，CH3)，δ1.25(t，J=7.2 Hz，6H，CH3)。

ESI-MS分析。C37H34N4O2[M+H]+的計算值為567.27，實測值為567.26。對于C37H34N4O2：C 78.42，H 6.05，N 9.89；實測值為C 78.66，H 6.02，N 9.85。

1.4 傳感器PS-RB-2和PS-R6G-2的制備

將氯甲基聚苯乙烯微球PS-Cl(0.2 g)在干燥的DMSO(30 mL)中溶脹過夜，然后加入化合物RB-2(0.67 g，1 mmol)或R6G-2(0.57 g，1 mmol)和三乙胺(0.1 g，1 mmol)。將反應(yīng)混合物在60 ℃下攪拌24 h，然后過濾。粗微球用甲醇的索氏提取法純化24 h，然后在30 ℃下真空干燥24 h，得到傳感器PS-RB-2(0.23 g)或PS-R6G-2(0.25 g)。

1.5 X線衍射晶體學

通過在室溫下緩慢蒸發(fā)甲醇溶液，可獲得合適的RB-2和R6G-2晶體。在293 K上使用ω-2θ掃描模式，在具有Mo-Kα輻射(0.071 073 nm)的Nonius CAD-4衍射儀上收集晶體數(shù)據(jù)。使用SHELXS-97直接解析結(jié)構(gòu)，并使用SHELXL-97[31]通過全矩陣最小二乘法在F2上對所有數(shù)據(jù)進行平方運算。所有非H-原子均按各向異性進行細化，將H原子添加到計算出的位置并使用騎乘模型精煉。各向同性溫度系數(shù)固定為H原子所連接的C原子的等效各向同性位移參數(shù)的1.2倍(Me為1.5倍)。CCDC-1874778(RB-2)和CCDC-1874772(R6G-2)包含本文的補充晶體學數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)可通過http://www.ccdc.cam.ac.uk/conts/retrieving.html免費獲得(或Cambridge Crystallographic Data Centre,12,Union Road,Cambridge CB2 1EZ,UK; fax:+441223336033)。

1.6 金屬離子選擇性

用乙腈(200 μL)溶脹PS-RB-2或PS-R6G-2(2 mg)，然后加入10 μL(80 μmol/L)Hg2+。分別加入10 μL(80 μmol/L)的Ca2+、Na+、K+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Cd2+、Fe2+、Cr3+和Ba2+后，在540 nm處激發(fā)測定熒光強度。

1.7 傳感器回收利用

相比于傳感器，乙二胺四乙酸(EDTA)與Hg2+具有更強的螯合作用，可導(dǎo)致熒光消失，并且傳感器恢復(fù)閉環(huán)不會影響其再次使用。基于此，筆者驗證了所設(shè)計的傳感器的重復(fù)利用效果，向結(jié)合Hg2+后的傳感體系中逐漸滴加EDTA，直至體系熒光強度恢復(fù)到初始值。重復(fù)Hg2+熒光滴定和EDTA絡(luò)合滴定步驟，并記錄每次的最高和最低熒光值。

1.8 實際樣品溶液的制備

從南京工業(yè)大學江浦校區(qū)獲得自來水和環(huán)境湖水，使用0.22 μm膜過濾[32]。從超市購買鯽魚樣品，稱質(zhì)量后放入消化罐中，然后加入濃硝酸(8 mL)。樣品在120 ℃下加熱1 h，冷卻后暴露于微波消解系統(tǒng)中，直至完全消解。將得到的溶液在120 ℃下加熱以除去酸。過濾消化液后，用1 μmol/L NaOH溶液將上清液的pH調(diào)至6～7[33]。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征結(jié)果

圖1 RB-2和R6G-2的晶體結(jié)構(gòu)

圖2 PS-Cl，PS-RB-2和PS-R6G-2的FT-IR光譜

通過掃描電子顯微鏡(SEM)分析了PS-Cl、PS-RB-2和PS-R6G-2的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，所有微球均保持良好的球形度和單分散性，形態(tài)無明顯變化。但是，從低放大倍數(shù)圖中(×300、×500)可以看出，相比較于PS-Cl、PS-RB-2及PS-R6G-2傳感器表面明顯更加粗糙，而且更高放大倍數(shù)(×2 000,×1 600)的表面電鏡圖也證實了此結(jié)論。表面形態(tài)的明顯變化表明固載成功。

圖3 PS-Cl、PS-RB-2和PS-R6G-2的SEM

2.2 熒光性質(zhì)

為了探索傳感器檢測特性，用Hg2+對PS-RB-2和PS-R6G-2進行了熒光滴定。由筆者之前的研究可知[24]，在4 min內(nèi)完成識別，在pH為6.0～9.0時熒光變化可忽略不計。逐步添加Hg2+后，在574 nm處觀察到增強的熒光發(fā)射(圖4)。對于PS-RB-2，Hg2+的線性濃度方程為y=63.42x+29.39(R2=0.995 9)；對于PS-R6G-2，Hg2+的線性濃度方程為y=58.13x+30.73(R2=0.996)。根據(jù)3s/k將檢測限確定為0.072 μmol/L，其中s為標準偏差，k為校正圖的斜率[38-39]。但是，與之相比，傳感器PS-RB-2表現(xiàn)出更高的熒光響應(yīng)和更低的檢測限0.065 μmol/L，也優(yōu)于傳感器Ⅰ[24]。此外，加入Hg2+后，微球表面的顏色從黃色變?yōu)槊倒寮t色，這說明傳感器可以實現(xiàn)熒光“開關(guān)”響應(yīng)和視覺識別Hg2+。

圖4 傳感器PS-RB-2(a)和PS-R6G-2(b)在乙腈中的熒光滴定光譜(激發(fā)波長為540 nm)

圖5為加入Ca2+、Na+、K+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Cd2+、Fe2+、Cr3+和Ba2+后觀察到弱的熒光增強作用(黑條)。由圖5可知，當添加Hg2+離子時，觀察到明顯的變化(紅色條)。與PS-R6G-2相比，PS-RB-2對Hg2+具有更好的選擇性和熒光響應(yīng)，并且具有明顯的顏色變化，從黃色到玫瑰紅，而其他離子保持黃色。它對Cu2+的抗干擾能力也優(yōu)于傳感器Ⅰ[24]。從其他金屬離子的選擇性來看，PS-RB-2具有與傳感器Ⅰ相似的性能。

圖5 PS-RB-2(a)和PS-R6G-2(b)對乙腈中各種金屬離子的熒光響應(yīng)

2.3 檢測機制

PS-RB-2和PS-R6G-2與Hg2+的檢測機制如圖6所示。由圖6可知，一開始，羅丹明是以閉環(huán)形式存在，不發(fā)出明顯的熒光。通過添加Hg2+后，PS-RB-2和PS-R6G-2可以通過N和O原子與Hg2+螯合，從而導(dǎo)致閉環(huán)打開，并在574 nm處出現(xiàn)明顯的顏色變化和強烈的熒光發(fā)射。

圖6 PS-RB-2和PS-R6G-2對Hg2+的檢測機制

此外，采用EDTA滴定探索了傳感器的重復(fù)使用性能，EDTA(10 μmol/L)與Hg2+(4 μmol/L)溶液交替處理后的螯合作用更強，可導(dǎo)致熒光消失，并且傳感器恢復(fù)閉環(huán)，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，PS-RB-2和PS-R6G-2在乙腈中可重復(fù)使用3次以上。然而，隨著重復(fù)時間的增加，熒光強度會降低，這可能是由于一些羅丹明衍生物在聚苯乙烯微球表面的損失。另外，表面顏色在重復(fù)使用的過程中不斷變化，表明固載在微球上的羅丹明呈“開-關(guān)”狀態(tài)。

圖7 Hg2+(4 μmol/L)和EDTA(10 μmol/L)溶液交替處理后PS-RB-2(a)和PS-R6G-2(b)的熒光強度變化

為了探索不同聚苯乙烯微球?qū)鞲衅鞯挠绊?，將PS-RB-2和PS-R6G-2的分析性能與傳感器Ⅰ[24]進行了比較。傳感器Ⅰ采用氯乙?；郾揭蚁┪⑶?200 μm)作為載體，羅丹明RH作為識別探針，結(jié)果如表1所示。由表1可知，具有較小尺寸的PS-RB-2和PS-R6G-2具有較低的檢測極限，而諸如響應(yīng)時間、選擇性和可回收性的其他性質(zhì)沒有減弱。尺寸的減小可以增加比表面積和負載量。此外，由于氯乙?；蟮幕盍?，氯乙?；奈⑶蚍€(wěn)定性低于氯甲基微球。在氯乙酰化微球的合成過程中，還會發(fā)生其他副反應(yīng)，會減少Cl的含量，進而降低了微球負載率。另外，PS-RB-2和PS-R6G-2可以在室溫條件下使用，沒有特殊條件，操作相對簡單。與某些Hg2+化學傳感器相比[13-14]，盡管它們檢測限低、選擇性好，但重復(fù)使用性差限制了它們的大規(guī)模應(yīng)用。在固相載體(如聚苯乙烯微球)上修飾小分子熒光探針可以解決此問題。但是，引入較大尺寸的載體可能會降低其檢測性能，例如檢出限。因此，筆者選擇較小尺寸的氯甲基微球作為載體，得到了具有良好的檢測和重復(fù)使用性能的固相傳感器PS-RB-2和PS-R6G-2。PS-RB-2和PS-R6G-2對Hg2+的選擇性高、成本節(jié)約、可回收利用對環(huán)境友好，這使得在檢測真實樣品種具有非常好的應(yīng)用前景。

表1 3種傳感器的分析性能比較

2.4 與傳統(tǒng)方法的比較

與一些傳統(tǒng)的無熒光化學傳感器方法相比較，本工作中的方法具有更低的檢出限，結(jié)果如表2所示。與傳統(tǒng)的儀器分析法相比較，雖然檢出限不如儀器分析法低，但本方法更加省時，成本低，且可以重復(fù)利用，這進一步證實了本固相熒光傳感器的優(yōu)異性。

表2 與傳統(tǒng)方法的比較

3 應(yīng)用

將傳感器PS-RB-2用于實際樣本的檢測證實其可靠性和實用性。分別測定了自來水、湖水和鯽魚中的Hg2+。通過標準添加方法對所有樣品進行分析，這些方法是根據(jù)環(huán)境水和魚類中可能存在的金屬離子制備的，并采用所建立的方法進行分析，結(jié)果見表3。

表3 實際樣品中Hg2+的加標回收結(jié)果(n=3)

從表3可以看出，自來水、湖水和鯽魚的回收率分別為92.60～105.80%、98.45～106.10%和91.30～105.84%，加標回收率研究的相對誤差低于10%。這表明分析結(jié)果在可接受的范圍內(nèi)。因此，建立的方法簡便、快速、環(huán)境友好且可靠，證實其可用于實際水和食品樣品中Hg2+的檢測。

值得注意的是，這些傳感器是可重復(fù)利用的。Hg2+的失去可使它們恢復(fù)到以前的狀態(tài)。此外，筆者還開發(fā)了簡單的PS-RB-2填充的固相萃取柱(圖8)，并用其快速分析乙腈中Hg2+的濃度。填充層最初為淺黃色，當10 mg/L Hg2+緩慢流動時變?yōu)榧t色。更重要的是，當使用EDTA流動數(shù)次后，它變成淺黃色。此循環(huán)過程至少可以重復(fù)3次。

A—只有PS-RB-2；B—10 mg/L Hg2+流入A柱；C—EDTA幾次流經(jīng)C柱；D—10 mg/L Hg2+穿過C柱

4 結(jié)論

筆者開發(fā)了一種基于羅丹明-PAHs衍生物和聚苯乙烯微球的Hg2+檢測方法。通過將芘或萘熒光團引入聚苯乙烯微球，可以合成2個新型的固相熒光傳感器PS-RB-2和PS-R6G-2，并獲得了較低的檢測限(PS-RB-2為0.065 μmol/L)。提出了基于Hg2+螯合誘導(dǎo)羅丹明螺內(nèi)酰胺開環(huán)的傳感機制，并在理論層面基于晶體結(jié)構(gòu)進行了探討。PS-RB-2傳感器已成功應(yīng)用于自來水、湖水和鯽魚樣品中的Hg2+監(jiān)測。最后，開發(fā)了基于PS-RB-2的固相萃取柱，通過觀察顏色變化(從黃色到玫瑰紅)來快速檢測Hg2+。PS-RB-2可實現(xiàn)對Hg2+高選擇性、瞬時響應(yīng)、良好的抗干擾性以及可回收性，使其成為非常具有應(yīng)用潛力的固相熒光傳感器，可以進一步監(jiān)測環(huán)境樣品中的Hg2+。