高 璐，孫嘉笛，王利平，紀(jì) 劍，孫秀蘭

(江南大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

睪酮(testosterone，T)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)常見的具有性激素作用的一種類固醇激素，具有提高生殖器官的發(fā)育、調(diào)節(jié)生殖代謝過程的作用[1]。包括睪酮在內(nèi)的性激素具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)同化作用，使動(dòng)物肉質(zhì)品質(zhì)得到改善，提高飼料的轉(zhuǎn)化效率和出欄率[2-3]，經(jīng)常被添加在畜禽等飼料中，給商家?guī)順O高的養(yǎng)殖效益。激素濫用導(dǎo)致的動(dòng)物及人的健康問題越來越嚴(yán)重[4]，長期攝入激素會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)分泌紊亂，損害肝、腎等器官，從而大大增加致癌、致畸的風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。

針對動(dòng)物源食品中激素超標(biāo)的現(xiàn)象，我國已出臺(tái)了相關(guān)的法律法規(guī)，如《關(guān)于嚴(yán)禁非法使用獸藥的通知》《獸用處方藥和非處方藥管理辦法》《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)》[8-9]和《食品中獸藥最大殘留限量》[10]等。國際上，歐盟理事會(huì)第96/22/EC號(hào)指令禁止以促進(jìn)生長為目的在肉食性動(dòng)物中添加自然或人工合成的性激素，以確保歐盟內(nèi)的人類健康保護(hù)[11]。如今，國內(nèi)外社會(huì)仍存在非法添加包括睪酮在內(nèi)的性激素事件，為了確保人類的食品安全和健康，建立相關(guān)簡便、靈敏的檢測技術(shù)是當(dāng)務(wù)之急。

目前，睪酮傳統(tǒng)的理化檢測方法包括液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)、毛細(xì)管電泳法、熒光光譜分析法和拉曼光譜法等方法[12-14]。其中，LC-MS有較高的分離能力和鑒別能力，電泳法和熒光光譜法所需樣品量和試劑消耗量少，拉曼光譜法對樣品前處理極為簡單[15]。但是上述方法或多或少存在技術(shù)缺陷和條件不足，比如耗費(fèi)較高，實(shí)驗(yàn)操作人員需要具有專業(yè)的技術(shù)，對實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)條件的要求高，而且準(zhǔn)備工作耗時(shí)長等[15]。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是在免疫酶方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型免疫測定手段[16]，具有特異性強(qiáng)、靈敏、簡便、準(zhǔn)確和樣品通量高等優(yōu)點(diǎn)[17]。睪酮是小分子物質(zhì)，屬于半抗原，只有當(dāng)其與載體蛋白結(jié)合后，才能獲得其包被原性[18]。梁康建等[19]研制了檢測己烯雌酚殘留的ELISA試劑盒，歷經(jīng)為期較長的實(shí)驗(yàn)，該試劑盒可以用于豬肉、雞肉、魚肉及飼料等樣品的批量檢測，因其目標(biāo)物為雌激素，無法做到對睪酮的特異性檢測，并且國內(nèi)市面上幾乎沒有對睪酮?dú)埩魴z測的ELISA試劑盒。

當(dāng)前，人們對食品安全的呼聲越來越高，開發(fā)一種用于對食品中殘留的睪酮進(jìn)行高效、便捷檢測的技術(shù)勢在必行。本文中，筆者應(yīng)用混合酸酐法得到睪酮人工抗原，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，同時(shí)與睪酮單克隆抗體結(jié)合，建立一種睪酮酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

睪酮標(biāo)準(zhǔn)品、羧甲基羥胺半鹽酸(CMO)、N，N-二甲基甲酰胺、卵清蛋白(OVA)、睪酮單克隆抗體，Sigma公司；氯甲酸異丁酯，F(xiàn)luka公司；三乙胺，上?；瘜W(xué)試劑公司；羊抗兔IgG，北京博奧森有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectronicl.70型紫外可見分光光度計(jì)，意大利GBC公司；NICOLET NEXUS470型傅里葉變換紅外光譜儀，美國熱電公司；MK3酶標(biāo)儀，上海智理科學(xué)儀器有限公司；微型凝膠電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 睪酮肟化及人工抗原的合成

用高濃度反應(yīng)液一步合成法將睪酮肟化[20]。1 mmol睪酮標(biāo)準(zhǔn)品溶于無水吡啶，加入2 mmol CMO，50 ℃攪拌反應(yīng)30 min，減壓蒸餾去吡啶。殘余物用乙酸乙酯溶解，加適量水清洗，取上層油樣，加入少量無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去乙酸乙酯，殘余物用乙醚重結(jié)晶搗碎得到肟化后的睪酮半抗原。

采用混合酸酐法[21]將半抗原與OVA偶聯(lián)，得到睪酮包被抗原。睪酮半抗原用N,N-二甲基甲酰胺攪拌溶解，加入三乙胺，4 ℃下反應(yīng)1 h，加入氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)l h，同時(shí)將OVA溶于磷酸鹽緩沖液中，加入N,N-二甲基甲酰胺，4 ℃下攪拌反應(yīng)1 h，逐滴滴加上面半抗原反應(yīng)好的產(chǎn)物，4 ℃條件下反應(yīng)4 h。先后用磷酸緩沖液和蒸餾水透析2 d，期間多次換液，冷凍干燥即得到偶聯(lián)蛋白后的睪酮人工抗原(T-OVA)。

1.3.2 人工抗原的鑒定

1)紫外掃描光譜法鑒定。取睪酮、OVA標(biāo)準(zhǔn)品以及制備好的T-OVA，用50%甲醇-水溶液作稀釋液，稀釋至一定濃度后進(jìn)行紫外掃描光譜鑒定，用石英比色皿，稀釋液作參比溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)檢測其特征吸收峰[22]。

2)紅外光譜法鑒定。取睪酮、OVA標(biāo)準(zhǔn)品以及制備好的T-OVA按1∶ 150(質(zhì)量比)加入干燥的KBr粉末，置于瑪瑙研缽中，在紅外燈照射下研磨、混勻，裝壓片模具在 8 000 N壓力下加壓，制得厚度1 mm的透明KBr樣品晶片，上機(jī)檢測[23]。

3)SDS-PAGE電泳鑒定。取OVA標(biāo)準(zhǔn)品和制備好的T-OVA稀釋至一定濃度，根據(jù)蛋白電泳預(yù)制膠試劑盒說明書進(jìn)行制膠、上樣、電泳、染色、脫色等步驟，觀察脫色后凝膠板的長度和每個(gè)蛋白質(zhì)樣品移動(dòng)距離[24]。

1.3.3 間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用碳酸鹽緩沖液稀釋制備好的人工抗原，滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后倒去包被液，洗滌液清洗后拍干，封閉液滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后洗滌拍干。按照間接競爭ELISA法，參照文獻(xiàn)[25]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測限LOD=3σ/S，其中σ為空白樣品標(biāo)準(zhǔn)差，S為斜率。

1.3.4 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

將樣品分別按照0、1、5、10和20 μg/L 5個(gè)水平添加睪酮標(biāo)準(zhǔn)品。取2 g組織(豬肉)均勻物，加入6 mL乙腈溶液，充分振蕩2 min，在4 500 r/min、15 ℃條件下離心10 min，取上清液4 mL，在56 ℃條件下N2吹至完全干燥。加入2 mL正己烷充分溶解，再加入1 mL去離子水振蕩，在4 500 r/min、15 ℃條件下離心5 min后，去上層液相，取下層液相與50%甲醇-PBS溶液以體積比1∶ 1混合，用于分析，每個(gè)濃度取4個(gè)平行組。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工抗原結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 紫外吸收光譜驗(yàn)證人工抗原

將睪酮、OVA標(biāo)準(zhǔn)品以及制備好的T-OVA稀釋至一定濃度后進(jìn)行紫外掃描光譜鑒定，在200～400 nm波長范圍內(nèi)檢測其特征吸收峰，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，睪酮半抗原在255 nm處有典型吸收，OVA標(biāo)準(zhǔn)品在280 nm處有最大吸收峰，而T-OVA 包被原的最大吸收峰則位于220 nm處，這說明睪酮人工抗原偶聯(lián)物最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移，并與其前體物質(zhì)有不同的紫外吸收特征，初步表明偶聯(lián)成功。

圖1 T、OVA和T-OVA的紫外吸收譜圖

2.1.2 紅外光譜驗(yàn)證人工抗原

對睪酮、OVA標(biāo)準(zhǔn)品以及制備好的T-OVA進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，睪酮標(biāo)準(zhǔn)品在3 300 cm-1處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，這是羥基的特征峰，而人工抗原T-OVA無此吸收峰，表明半抗原衍生化成功。同時(shí)，OVA標(biāo)準(zhǔn)品和T-OVA免疫原在2 500～3 200 cm-1和1 660～1 500 cm-1的區(qū)域內(nèi)具有相似的吸收峰，這是OVA標(biāo)準(zhǔn)品中氨基酸的特征峰，說明合成的包被原中含有OVA，證明T-OVA中含有睪酮。據(jù)此確定T-OVA人工抗原偶聯(lián)成功。

圖2 T、OVA和T-OVA的紅外譜圖

2.1.3 SDS-PAGE電泳驗(yàn)證人工抗原

所得人工抗原SDS-PAGE電泳圖如圖3所示。由圖3可知，OVA標(biāo)準(zhǔn)品的條帶相比T-OVA的條帶較深且寬，向下移動(dòng)的距離稍遠(yuǎn)，表明T-OVA的遷移速率比OVA的遷移速率小，偶聯(lián)后包被原的分子量比載體OVA的分子量大，證明偶聯(lián)抗原制備成功。

圖3 OVA和T-OVA的SDS-PAGE電泳圖

2.2 間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照間接競爭ELISA法，以睪酮標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、1、5、10、20、25 μg/L進(jìn)行OD值的測定。以睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，曲線在1～25 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限可達(dá)到0.261 7 μg/L，相關(guān)系數(shù)R=0.995 6。(B為OD值，B0為對照組OD值，下同。)

圖4 睪酮ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 睪酮ELISA檢測穩(wěn)定性測試

用碳酸鹽緩沖液稀釋睪酮包被抗原，滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后倒去包被液，洗滌液清洗后拍干，封閉液滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后洗滌拍干，待孔板晾干后真空包裝，于-20 ℃保存。分別于第3天、第7天、第10天、第14天進(jìn)行ELISA方法檢測，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，擬合線性關(guān)系幾乎重疊，且表1顯示5次測定時(shí)間所得批間差異(CV)均小于5%。

圖5 睪酮ELISA檢測的穩(wěn)定性結(jié)果

表1 睪酮ELISA檢測穩(wěn)定性結(jié)果差異值

2.4 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

樣品分別按照0、1、5、10、20 μg/L 5個(gè)水平添加睪酮標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果如表2所示。

表2 睪酮ELISA檢測的樣品加標(biāo)回收結(jié)果

由表2可知，基于睪酮激素建立的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測法對樣本的平均加標(biāo)回收率為87.51%～102.83%，說明建立的睪酮ELISA檢測法具有很高的準(zhǔn)確度，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中睪酮的檢測。

3 結(jié)論

采用混合酸酐法合成睪酮人工包被抗原，與睪酮單克隆抗體結(jié)合，建立了一種檢測靈敏度高、方法簡單、高效的酶聯(lián)免疫檢測方法，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～25 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R=0.995 6，最低檢測限可達(dá)0.261 7 μg/L。檢測方法穩(wěn)定性測試中，5次測定時(shí)間所得批間差異均小于5%，樣品加標(biāo)回收率為87.51%～102.83%，可應(yīng)用于實(shí)際樣品中睪酮的檢測。本研究為進(jìn)一步自主開發(fā)高效率且應(yīng)用于市場的睪酮ELISA檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為保障我國肉制品質(zhì)量安全提供一種有效的技術(shù)手段。