王吉靜 徐金義 姬艷芳 鄭帥 杜杰

450003 鄭州大學人民醫(yī)院(河南省人民醫(yī)院)心肺功能科(王吉靜、徐金義)；450003 河南省疾病預防控制中心(姬艷芳)；100029 首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 北京市心肺血管疾病研究所(鄭帥、杜杰)

心肌缺血和心肌炎等是導致心肌損傷的最常見原因，若診治不及時可發(fā)展為心力衰竭。急性心肌損傷常伴發(fā)大量炎癥細胞的浸潤和細胞凋亡和壞死，大量心肌細胞的喪失導致心臟損傷加重和功能失調(diào)[1-4]。急性心肌梗死(myocardial infarction，MI)等應激情況可誘導糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)釋放增加。糖皮質激素主要是通過和細胞內(nèi)的糖皮質激素受體(glucocorticoid Receptor，GR)結合，發(fā)揮其生理和藥理效應，對多種基因具有轉錄調(diào)控作用，有抗炎、抑制細胞凋亡等作用[5-6]。糖皮質激素及其受體并對心肌細胞損傷的影響尚不完全清楚。本實驗通過小鼠腹腔注射糖皮質激素(地塞米松)后制作MI模型和體外缺氧刺激心肌細胞系，觀察心肌細胞在應激作用下糖皮質激素的激活，分析其激活對心肌細胞炎癥因子的表達、對細胞凋亡和壞死的作用及心肌損傷后心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

12周齡雄性C57B/L6J小鼠80只，SPF級，由維通利華生物科技有限公司提供，在北京安貞醫(yī)院實驗動物中心所屬的SPF級動物房飼養(yǎng)，按照隨機數(shù)字表法隨機分為生理鹽水(鹽水)組和地塞米松(地米)組，再分別分為假手術組(sham)和手術組(MI)，即鹽水+假手術組(20只)、地米+假手術組(20只)、鹽水+MI組(20只)和地米+MI組(20只)。手術組結扎小鼠左冠狀動脈前降支制作MI模型，假手術組只繞線不結扎，并于術前24 h分別腹腔注入生理鹽水及地米(20 mg/kg)。本研究符合醫(yī)學動物研究倫理學要求。

1.2 MI模型的復制和超聲心動圖檢測心功能

使用實驗室常規(guī)方法制作MI模型[7]。MI后第1天和7天，應用Vevo2100超聲成像系統(tǒng)(Visual Sonics公司，加拿大)進行超聲心動圖檢查，探頭頻率30 MHz，測量左室(left ventricular，LV)舒張末期內(nèi)徑(LV end-diastolic diameter，LVEDD)，左室收縮末期內(nèi)徑(LV end-systolic diameter，LVESD)，算出左室射血分數(shù)(LV ejection fraction，LVEF)和短軸縮短率(LV fractional shortening，LVFS)。

1.3 心臟病理切片制備和Masson、免疫組織化學染色、TUNEL染色

模型復制后第1、7天取材，石蠟切片脫蠟至水，常規(guī)Masson試劑染色和免疫組化染色，用尼康顯微鏡(尼康公司，日本)采集圖像后測量心梗面積和觀察磷酸化GR的表達[8]。于MI術后第1天心梗收取心臟，分離左心室，取梗死交界區(qū)心肌組織進行冰凍切片，按TUNEL試劑盒(Promega公司，美國)說明書進行染色，DAPI封片，尼康N90i顯微鏡圖像采集圖像，NIS分析軟件分析凋亡細胞的百分比。

1.4 細胞因子檢測試劑盒和實時定量PCR檢查脂聯(lián)素的蛋白和mRNA水平

術后第7天收取心臟，分離左心室，將左心室分為梗死區(qū)和非梗死區(qū)[8]。取梗死區(qū)，研磨法并加入組織裂解液提取總蛋白，使用多因子試劑盒檢測心臟組織脂聯(lián)素細胞因子的表達，軟件分析系統(tǒng)計算細胞因子的蛋白濃度；取梗死區(qū)，Trizol法抽提總RNA，測定RNA純度，濃度后反轉為cDNA，RT-PCR法檢測脂聯(lián)素因子的mRNA表達(脂聯(lián)素：正義鏈5’-CCCAGTCATGCCGAAGATGA-3’，反義鏈5’-CACAAGTTCCCTTGGGTGGA-3’)。

1.5 體外H9c2心肌細胞培養(yǎng)和蛋白印跡技術、碘化丙啶/Hoechst染色法

H9c2大鼠心肌細胞系于培養(yǎng)皿中提前12 h用地米(0.1 μM、1 μM)，或提前給予GR拮抗劑RU486(1 μM)處理，再替換為缺氧溶液處理并放入缺氧倉(5% CO2、1% O2、94% N2)90 min，恢復正常培養(yǎng)情況，對照組：給予DMEM高糖培養(yǎng)液[9]，處理后的細胞提取總蛋白，采用蛋白印跡技術(western Blot)分析磷酸化GR的表達，一抗為phospho-GR(Cell Signaling Technology公司，美國)，對照蛋白：GAPDH單克隆抗體(中杉金橋，北京)，結果采用Odyssey掃描儀掃描并進行光密度值分析。96孔板處理心肌細胞，經(jīng)缺氧緩沖液處理后進行原位碘化丙啶和Hoechst 33258(終濃度：1 μg/mL，BD公司，美國)染色，Image Xpress XL高內(nèi)涵篩選分析儀掃描分析死/活細胞百分比，MetaXpress軟件計算凋亡及壞死細胞占全部細胞(hoechst染色)百分比。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MI模型制作后觀察磷酸化GR的表達

通過對梗死后1 d小鼠心臟切片，免疫組化染色(圖1A)和Western blot結果(圖1B)，發(fā)現(xiàn)較鹽水+手術組，地米+手術組的心肌細胞磷酸化的GR表達明顯增加(P<0.05)。

A：鹽水+手術組和地米+手術組心臟切片的磷酸化糖皮質激素受體的免疫組化染色結果(×400，n=5)；B：小鼠心肌梗死后心臟組織磷酸化糖皮質激素受體的western blot結果(n=5)，aP<0.05

2.2 地塞米松預處理改善小鼠心肌梗死后心功能

超聲心動圖檢測MI前及MI后1 d和7 d時的小鼠心功能，發(fā)現(xiàn)給予地米+MI組小鼠的左心室功能較鹽水+MI組升高，左室LVEF、LVEDD、LVESD、LVFS等心功能指標均明顯改善(均為P<0.05)(表1)。

表1 超聲心動圖檢測心肌梗死后心功能

2.3 地米對小鼠MI后心臟損傷的影響

通過對MI后7 d小鼠心臟切片Masson染色發(fā)現(xiàn)，地米+MI組小鼠的心臟梗死面積減小(34.8%±5.8% 比 44.1%±3.6%，P<0.05)，提示地米可以減輕梗死后心臟損傷(圖2)。

A：四組小鼠的心臟切片的Masson染色結果(×40，n=5)；B：梗死面積結果(n=5)，生理鹽水+MI組與地塞米松+MI比較，aP<0.05

2.4 地米升高小鼠MI后心肌的脂聯(lián)素水平

通過多細胞因子檢測試劑盒檢測MI后心臟組織中細胞因子的表達，發(fā)現(xiàn)給予地米+MI組的脂聯(lián)素的蛋白水平有明顯的升高(2.82倍，P<0.05)，實時定量PCR方法發(fā)現(xiàn)地米+MI組的脂聯(lián)素mRNA水平明顯升高(6.45倍，P<0.05)。

2.5 地米減輕心肌細胞凋亡水平

對MI后1 d的心肌組織行TUNEL染色，觀察其細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)，地米可減輕MI后細胞凋亡(圖3)。

A：TUNEL試劑盒染色檢測小鼠心梗后1 d心臟組織的細胞凋亡水平，綠色為凋亡細胞，藍色為細胞核(n=5)；B：凋亡細胞百分比，生理鹽水+MI組與地塞米松+MI比較，aP<0.05

2.6 缺氧刺激導致心肌細胞磷酸化GR升高

體外培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細胞系，在正常培養(yǎng)基和缺氧緩沖液處理后，western blot檢測觀察心肌細胞磷酸化GR的表達，發(fā)現(xiàn)在缺氧buffer處理12 h后，心肌細胞磷酸化的GR表達增加(1.75倍，P<0.05)。

2.7 地米可減輕心肌細胞壞死

用H9c2大鼠心肌細胞系，發(fā)現(xiàn)缺氧刺激可導致心肌細胞的凋亡和壞死明顯增加，而地米可抑制缺氧導致的細胞的凋亡和壞死，而用RU486拮抗GR后，地米的抑制凋亡和壞死作用消失(圖4)。

a-f：H9c2大鼠心肌細胞系在正常處理、缺氧處理、缺氧刺激前加地塞米松 0.1 μM，地塞米松 1 μM，RU486 1 μM，RU486 1 μM+地塞米松 1 μM，PI/Hoechst染色貼壁細胞，使用高內(nèi)涵熒光掃描儀檢測PI陽性細胞的占全部細胞的個數(shù)，gP<0.05，hP<0.01，各組n=6

3 討論

糖皮質激素以其抗炎及免疫抑制作用廣泛應用于臨床炎癥及免疫相關疾病[5]。生理或病理性應激均可以導致循環(huán)系統(tǒng)糖皮質激素的升高，糖皮質激素通過與GR結合，調(diào)節(jié)機體代謝和生化穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞特異敲除GR(Cardio GRKO)小鼠自發(fā)性出現(xiàn)心肌肥厚和左心室收縮功能異常，最終死于心力衰竭，而基因表達顯示，心肌細胞缺失GR后，大量與心血管疾病相關的基因發(fā)生改變，包括損害鈣離子的轉移、增加氧化應激、增加細胞死亡等基因表達增加，而抑制心肌肥厚、促進細胞存活等基因表達下調(diào)[10]；而以往動物實驗及體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質激素可以通過下調(diào)轉錄生長因子、腫瘤壞死因子等炎癥因子的表達，急性誘導一氧化氮合酶產(chǎn)生，誘導動物心肌細胞環(huán)加氧酶2產(chǎn)生，上調(diào)心肌細胞脂質運載蛋白前列腺素D的表達等，改善心肌缺血缺氧后心臟功能，保護缺血再灌注后心肌損傷，發(fā)揮心臟保護作用[11]。而我們實驗發(fā)現(xiàn)，給予糖皮質激素后發(fā)現(xiàn)心肌細胞GR激活增加(圖1)，梗死面積減小(圖2)，可能與其升高心肌脂聯(lián)素水平，減少缺血缺氧刺激所致心肌細胞凋亡及壞死有關(圖3、圖4)，從而發(fā)揮對缺血缺氧后心肌細胞的保護作用，改善心臟功能(表1)。

脂聯(lián)素有抗炎、抗動脈粥樣硬化和改善胰島素抵抗等多種作用，是預測冠心病和糖尿病的新標志物。大量流行病學證據(jù)支持脂聯(lián)素在心血管中的保護作用：血清脂聯(lián)素與冠狀動脈的狹窄程度呈負相關；急性MI后血液中的低脂聯(lián)素水平可預示不良心血管事件的發(fā)生，MI后血漿中脂聯(lián)素水平與心肌射血分數(shù)的恢復正相關[12-13]。體外實驗中，脂聯(lián)素可促進細胞存活、抑制細胞死亡；源自心肌細胞的脂聯(lián)素具有生物活性和生理功能，可能通過多種路徑發(fā)揮其對MI后心肌的保護作用，明顯改善MI后心室重構及心臟功能[14]。以往研究發(fā)現(xiàn)糖皮質激素可升高血清中脂聯(lián)素的表達[15]，我們的實驗進一步證實，糖皮質激素后可以增加心臟組織中脂聯(lián)素的蛋白和mRNA水平，繼而發(fā)揮保護心梗后心功能的作用，說明糖皮質激素對心肌細胞的保護作用與脂聯(lián)素表達相關。

MI早期，缺血缺氧所致大量心肌細胞的凋亡和壞死，嚴重影響存活率和心功能。已有實驗證明糖皮質激素可減少心肌細胞凋亡，減輕心肌損傷[16]：動物實驗發(fā)現(xiàn)糖皮質激素可以通過誘導心肌細胞bcl-xl等抗凋亡基因的表達，減少心梗后心肌細胞凋亡，體外實驗發(fā)現(xiàn)糖皮質激素可以誘導心肌細胞在應激刺激下抗凋亡基因的表達增加和促凋亡基因的表達下調(diào)[17]。我們實驗結果發(fā)現(xiàn)，GR激活后，可抑制缺氧刺激導致的心肌細胞凋亡和壞死，可能與Bcl-2/Bax基因調(diào)控相關。

本研究尚存一定局限性：(1)GR激活對心肌損傷后炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的釋放，其相關信號通路需要進一步的研究；(2)本實驗僅通過復制小鼠MI模型來觀察GR對心肌細胞損傷的影響，缺少其他影響心肌細胞功能的模型進一步實驗；(3)我們進一步有心肌細胞特異性基因敲除小鼠(MGRKO)實驗來驗證，心肌細胞特異性缺失GR對MI后心功能、心肌細胞的凋亡、炎癥細胞的浸潤等均有明顯影響，但對心肌細胞的其他作用及長期心功能影響的需進一步的實驗驗證。總之，糖皮質激素可能通過激活其受體，減少缺血缺氧刺激導致的炎癥因子釋放、心肌細胞凋亡和壞死，保護心臟損傷后心臟功能。

利益沖突：無