秦少華 王新舜 杜玉祥 曹寶國

糖尿病是冠心病(CAD)的等危癥，二者彼此獨(dú)立又相互聯(lián)系。2018年美國糖尿病協(xié)會發(fā)布的指南[1]推薦，對于糖尿病合并無癥狀CAD患者，在有效控制心血管疾病危險(xiǎn)因素的前提下，A級證據(jù)并不推薦將冠狀動脈(簡稱冠脈)檢查用于糖尿病患者篩查CAD。慢性炎癥反應(yīng)是糖尿病和CAD共同的病理基礎(chǔ)。Li等[2]發(fā)現(xiàn)炎癥因子可刺激血管壁局部活化的特定顆粒細(xì)胞大量分泌幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1(YKL-40)，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、趨化、遷移等損傷血管內(nèi)皮功能及細(xì)胞外基質(zhì)重建，從而參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和進(jìn)展。既往研究結(jié)果顯示，微小RNA(miRNA，miR)-30a參與炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程[3-4]。由此可見，miR-30a和YKL-40均與慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)。我們通過探討血清miR-30a和YKL-40在糖尿病合并CAD患者中的表達(dá)情況及其在冠脈病變過程中的作用，旨在為評估糖尿病合并CAD患者冠脈病變嚴(yán)重程度提供輔助參考依據(jù)。

對象與方法

1.對象：2018年1月～12月因不明原因胸痛于我院行冠脈造影(CAG)的2型糖尿病(T2DM)患者116例，其中男77例，女39例，年齡37～83歲，平均年齡(65.34±10.87)歲，85例確診為CAD(T2DM合并CAD組)，31例為單純T2DM患者(單純T2DM組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1型糖尿病、妊娠期糖尿病、繼發(fā)性糖尿病、糖尿病急性并發(fā)癥；(2)合并先天性心臟病、心肌炎、急/慢性感染、心肌梗死、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤；(3)曾接受靜脈溶栓、介入治療、搭橋手術(shù)。選取同期因胸痛行CAG及常規(guī)檢查結(jié)果均正常，且糖耐量試驗(yàn)正常者30例作為對照組，其中男19例，女11例，年齡34～82歲，平均年齡為(66.78±12.03)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)CAG：由兩位副主任醫(yī)師以上級別的介入專家根據(jù)Judkin’s法依次進(jìn)行右側(cè)和左側(cè)冠脈造影，采用CRSPC圖像處理系統(tǒng)定量分析冠狀動脈病變支數(shù)和狹窄程度。Gensini評分為0～30分為冠脈輕度病變，31～60分為冠脈中度病變，>60分為冠脈重度病變。

(2)血液樣本采集及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查：3組受試者均于入院次日清晨采集空腹外周靜脈血5 ml，37 ℃靜置30 min，1 000 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存用于提取血清總RNA。同時采集外周靜脈血3 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，2 h內(nèi)送檢生化指標(biāo)，包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等。同時3組受試者均行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。

(3)血清miR-30a水平檢測：采用Trizol試劑提取血清總RNA。采用凝膠電泳和分光光度法檢測RNA純度和濃度。取1 μg RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。按照3步法進(jìn)行實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)。以組織cDNA為模板，小分子U6為內(nèi)參，加入TaqDNA聚合酶、引物、SYBR Green I Msater配制20 μl反應(yīng)體系，95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)42次，72 ℃延伸30 s。miR-30a引物序列：上游引物：5’-TGG CCT TGT ACC GAT TGC TG-3’；下游引物：5’-GCT GCT CTT CCT TTC CTG TGT TC-3’)；U6引物：上游引物：5’-AAC TGT GCC AAC CAG TCC AA-3’；下游引物：5’-TCT TCT CAA ATG CCC TTT CAT CA-3’)。收集熒光信號，以2-ΔΔCt表示miR-30a相對表達(dá)水平。

(4)血清YKL-40水平檢測：采用人酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)檢測血清YKL-40水平。

(5)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-30a和YKL-40的靶向關(guān)系：通過在線生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(www.microrna.org)預(yù)測miR-30a的靶基因，采用XbaI和FseI(10 U/μl)對pGL3.0熒光素酶報(bào)告載體進(jìn)行雙酶切，在T4 DNA連接酶作用下，將設(shè)計(jì)好的miR-30a mimics序列連接至pGL3.0載體上，并進(jìn)行擴(kuò)增。利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行突變，構(gòu)建YKL-40突變質(zhì)粒。用YKL-40野生質(zhì)粒、突變質(zhì)粒分別與miR-30a mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，后續(xù)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，采用Promega GloMaxTM20/20發(fā)光檢測儀檢測熒光素酶活性。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于美國Sigma公司。

結(jié) 果

1.3組受試者一般資料和臨床資料比較:3組受試者性別、年齡、BMI、吸煙史、血脂、血壓比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組受試者空腹血糖(FPG)、OGTT 2 h血糖(2h PG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、血清miR-30及YKL-40水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中單純T2DM組和T2DM合并CAD組患者FPG、2h PG、HbAlc及血清YKL-40水平均高于對照組，血清miR-30a水平低于對照組(P<0.05)；且T2DM合并CAD組患者血清miR-30a水平低于單純T2DM組，血清YKL-40水平高于單純T2DM組(P<0.05)。見表1。

表1 3組受試者一般資料和臨床資料比較

2.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果:圖1顯示的是miR-30a序列與YKL-40的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域。將野生型YKL-40 3’-UTR的基因報(bào)告質(zhì)粒同miR-30a mimics共轉(zhuǎn)染后，熒光酶活性被明顯減弱(P<0.05)，其對熒光酶活性的抑制作用達(dá)48.62%，而將突變型YKL-40的基因報(bào)告質(zhì)粒與miR-30a mimics共轉(zhuǎn)染后，其未對熒光素酶活性產(chǎn)生明確影響。

圖1 miR-30a序列與YKL-40的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域

3.不同冠脈病變程度T2DM合并CAD患者血清miR-30a和YKL-40水平比較:輕、中、重度病變組T2DM合并CAD患者血清miR-30a(0.62±0.23比0.43±0.27比0.35±0.18)比和YKL-40水平[(85.58±29.15)ng/ml比(100.62±32.17)ng/ml比(117.98±41.13)ng/ml]比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中中、重度病變組患者血清miR-30a水平均低于輕度病變組，血清YKL-40水平高于輕度病變組(P<0.05)；重度病變組患者血清miR-30a水平低于中度病變組，血清YKL-40水平高于中度病變組(P<0.05)。

4.血清miR-30a和YKL-40水平的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在單純T2DM患者和T2DM合并CAD患者中，血清miR-30a與YKL-40水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.365、-0.589，P均<0.001)，而在對照組受試者中，血清miR-30a和YKL-40水平無相關(guān)性(r=-0.075，P=0.673)。

5.血清miR-30a和YKL-40診斷T2DM患者合并CAD的價(jià)值：ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-30a及miR-30a聯(lián)合YKL-40的ROC曲線下面積(AUC)均>0.7(P<0.05)，其診斷價(jià)值相對較高。見圖2和表2。

表2 血清miR-30a和YKL-40診斷T2DM患者合并CAD的ROC曲線分析結(jié)果

圖2 血清miR-30a和YKL-40診斷T2DM患者合并CAD的ROC曲線

討 論

YKL-40由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等合成[5]。王昌敏等[6]證實(shí)血清YKL-40在急性冠脈綜合征患者中的表達(dá)水平明顯升高，且與高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、P選擇素水平呈正相關(guān)。錢琦等[7]也發(fā)現(xiàn)CAD患者血清YKL-40水平高于健康人群。表明YKL-40可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，且可能反映冠脈病變的嚴(yán)重程度。本研究中，單純T2DM組和T2DM合并CAD組患者血清YKL-40水平均高于對照組，T2DM合并CAD組患者血清YKL-40水平高于單純T2DM組，且隨著冠脈病變程度的加重，血清YKL-40水平逐漸升高，表明糖尿病患者本身就存在慢性炎癥反應(yīng)，且隨著冠心病的進(jìn)展，炎癥反應(yīng)逐漸加重。

miR-30a在心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)。Huang等[8]研究結(jié)果顯示，miR-30a可能通過調(diào)控下游炎癥因子，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、粘附等過程。本研究中，我們首先通過在線生物學(xué)數(shù)據(jù)庫信息推斷YKL-40可能是miR-30a的下游靶基因，二者具有互補(bǔ)結(jié)合序列，通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果進(jìn)一步從分子水平證實(shí)miR-30a和YKL-40之間的靶向關(guān)系。因此，我們推測miR-30a可聯(lián)合YKL-40用于量化冠脈病變的進(jìn)程。本研究中，單純T2DM組和T2DM合并CAD組患者血清miR-30a水平均低于對照組，T2DM合并CAD組患者血清YKL-40水平低于單純T2DM組，且隨著冠脈病變程度的加重，血清YKL-40水平逐漸降低；Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在單純T2DM患者和T2DM合并CAD患者中血清miR-30a與YKL-40水平均呈負(fù)相關(guān)；ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-30a及miR-30a聯(lián)合YKL-40診斷T2DM患者合并CAD的價(jià)值相對較高，因此，我們推測miR-30a和YKL-40相互作用、共同參與冠脈粥樣硬化過程。

綜上所述，miR-30a及其下游靶分子YKL-40不僅參與T2DM和CAD血管炎癥反應(yīng)過程，而且與其冠脈病變程度密切相關(guān)。血清miR-30a水平降低和YKL-40水平升高可在一定程度上預(yù)警T2DM患者發(fā)生心血管并發(fā)癥，且有望成為診斷T2DM合并CAD的指標(biāo)之一，對于T2DM患者合并CAD的預(yù)防有一定的指示作用。