王凌星， 洪姍燕， 楊美麗， 黃紅紅

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 泉州 362000)

人類生命有三分之一是處在睡眠狀態(tài)，睡眠對人類身心健康的維持起著至關(guān)重要的作用。睡眠剝奪是指由于環(huán)境因素或自身原因?qū)е抡Ｉ硭杷吡坎荒艿玫綕M足的狀態(tài)[1],可分為急性睡眠剝奪和慢性睡眠剝奪[2]。在現(xiàn)代社會，慢性睡眠剝奪更為普遍并且容易遭到忽視，有越來越多的成年人每日睡眠時間不足6 h[3]。動物實驗已經(jīng)表明，慢性睡眠剝奪可以引起腦部小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性細(xì)胞因子表達(dá)的增加[4, 5]，這提示慢性睡眠剝奪可導(dǎo)致神經(jīng)炎性反應(yīng)，但睡眠剝奪對小膠質(zhì)細(xì)胞亞型的影響尚不明確。離子鈣接頭分子(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)，是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，而誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和精氨酸酶1(arginase1,Arg1)分別是小膠質(zhì)細(xì)胞亞型M1和M2的標(biāo)志物，因此在慢性睡眠剝奪大鼠腦部檢測上述指標(biāo)可以明確小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況及細(xì)胞亞型改變。

丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide)與芹菜種籽中提取的左旋芹菜甲素的結(jié)構(gòu)相同，其化學(xué)名是消旋-3-正丁基苯酞，是人工合成的消旋體。丁苯酞已被廣泛用于缺血性卒中患者，它可以增加缺血區(qū)域的腦血流量并改善微循環(huán)、保護線粒體功能、改善腦能量代謝促進(jìn)缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)[6, 7]。此外，動物實驗發(fā)現(xiàn)，丁苯酞可在糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷等多種疾病中抑制炎癥反應(yīng)[8-11]，并且其對炎癥反應(yīng)的影響是與小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的。但丁苯酞對慢性睡眠剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥影響尚不明確，本研究旨在通過建立大鼠模型，探討丁苯酞對慢性睡眠剝奪后腦部神經(jīng)炎癥的影響，為治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

Iba-1多克隆抗體(產(chǎn)品編號bs-1363R)、生物素標(biāo)記的二抗(產(chǎn)品編號bs-0295G-Bio)、BCA蛋白定量試劑盒(產(chǎn)品編號C05-02001)、 iNOS多克隆一抗(產(chǎn)品編號bs-0162R)、Arg1多克隆一抗(產(chǎn)品編號bs-23837R)、β-肌動蛋白多克隆一抗(β-actin，產(chǎn)品編號bs-10966R)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆IgG二抗(產(chǎn)品編號bs-0295G-HRP)、電化學(xué) (electro-chemi-luminescence,ECL) 超敏發(fā)光底物試劑盒(產(chǎn)品編號C05-07004)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；總RNA抽提試劑(Total RNA Isolation,Trizol，產(chǎn)品編號15596018)購自美國Invitrogen公司；熒光定量pcr儀(型號PIKO REAL 96)為美國Thermo Fisher科技公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 實驗動物

清潔級成年Sprague Dawley(SD)大鼠共32只，雌雄各16只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司(SCXK滬2012—0002)。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境的室溫為(20±1)℃，光照時間為8: 00-20: 00,可自由攝取食物和水。

1.3 建立大鼠慢性睡眠剝奪模型及丁苯酞干預(yù)

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組，即空白對照組、大平臺對照組、慢性睡眠剝奪組、丁苯酞干預(yù)組，每組8只(雌雄各半)。參照文獻(xiàn)[12, 13]采用改良多平臺睡眠剝奪法建立大鼠慢性睡眠剝奪模型，對慢性睡眠剝奪組和丁苯酞干預(yù)組大鼠進(jìn)行睡眠剝奪。睡眠剝奪箱中有8個高為8.0 cm、直徑 6.5 cm的圓形平臺，平臺間距為15 cm，平臺周邊注滿水，水溫保持在(22±1)℃，平臺高出水面約1.5 cm。大鼠可在平臺上自行攝取食物和水，并可在平臺間活動。當(dāng)大鼠在平臺上進(jìn)入睡眠的快速眼動期時，會出現(xiàn)肌肉松弛導(dǎo)致垂頭觸水或跌落水中而警醒，從而建立睡眠剝奪模型。大鼠睡眠剝奪時間為每日18 h(16: 00-次日10: 00)，余下的6 h大鼠在大飼養(yǎng)籠內(nèi)休息(次日10: 00-16: 00)，進(jìn)行連續(xù)28 d的睡眠剝奪。在相同時間內(nèi)，大平臺對照組大鼠放于大平臺箱內(nèi)，以消除水環(huán)境對大鼠的影響。大平臺箱與睡眠剝奪箱類似，但圓平臺間有鐵絲網(wǎng)格，大鼠在睡眠時不會跌落水中，大鼠被放入大平臺箱的時間與慢性睡眠剝奪組相同?？瞻讓φ战M大鼠不進(jìn)行任何干預(yù)。

丁苯酞干預(yù)組大鼠在睡眠剝奪28 d結(jié)束后腹腔注射100 mg/kg的丁苯酞，每日1次，共14 d。其他組大鼠這14 d內(nèi)腹腔注射同樣劑量的生理鹽水。

1.4 取材

每組隨機選取雌雄大鼠各2只，于麻醉后進(jìn)行心臟灌注，取腦組織石蠟包埋，另外4只于麻醉后直接取腦部額葉液氮速凍后-80℃保存。

1.5 免疫組化檢測各組大鼠額葉Iba-1陽性細(xì)胞

取腦組織蠟塊切片，厚度為4 μm，烤片后脫蠟至水，熱修復(fù)抗原，室溫下滅活內(nèi)源性酶，與稀釋后的Iba-1多克隆抗體(1∶500)孵育，4℃過夜后沖洗，與生物素標(biāo)記的多克隆IgG二抗(1∶1 000)孵育后沖洗，DAB顯色，封片后顯微鏡下觀察。Iba-1陽性細(xì)胞呈棕黃色，每張切片隨機選取額葉皮質(zhì)的5個視野，于400倍鏡下用Image Pro-plus 6.0圖像軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，并取平均值。

1.6 Western blot檢測各組大鼠額葉iNOS、Arg1表達(dá)

取腦組織低溫研磨，冰上裂解后離心，提取上清后BCA法蛋白定量。使用聚丙烯酰胺凝膠對蛋白進(jìn)行電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，沖洗后5%脫脂奶粉封閉，分別與稀釋后的iNOS多克隆一抗(1∶500)、Arg1多克隆一抗(1∶500)、Actin多克隆一抗(1∶1 000)孵育，低溫下過夜，沖洗后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆IgG二抗(1∶1 000)孵育，沖洗后ECL顯色曝光，Image J軟件分析各條帶吸光度，以目的條帶/Actin吸光度作為各蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 實時定量PCR檢測各組大鼠額葉白介素-1(interleukin-1,IL-1)mRNA、IL-6 mRNA、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表達(dá)

Trizol提取腦組織總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。使用熒光素SYBR Green Ⅰ標(biāo)記定量，實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增，擴增條件為：95℃ 3 min，然后95℃15 s，60℃50 s，擴增40個循環(huán)。內(nèi)參為Actin，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列如下：IL-1β上游引物5’-CAGCAGCATCTCGACAAGAG-3’，下游引物5’-AAAGAAGGTGCTTGGGTCCT-3’，擴增片段長度123 bp；IL-6上游引物5’- CCAGTTGCCTTCTTGGGACT-3’，下游引物5’-GTCTGTTGTGGGTGGTATCCTCTGT-3’，擴增片段長度100 bp；IL-10上游引物5’-AGAGAAGCTGAAGACCCT-3’，下游引物5’-GCAGTTGATGAAGATGTCAAACTC-3’，擴增片段長度163 bp；TNF-α上游引物5’-AAAGCATGATCCGAGATGTGGAA-3’，下游引物5’-AGTAGACAGAAGAGCGTGGTGGC-3’，擴增片段長度142 bp；Actin上游引物5’-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’，擴增片段長度223 bp。以空白對照組為參照,采用2-△△Ct法計算，△Ct= Ct(目的基因)-Ct(Actin)，-△△Ct=△Ct(參照樣本)-△Ct(待測樣本)，以2-△△Ct作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞對慢性睡眠剝奪大鼠額葉Iba-1陽性細(xì)胞的影響

Iba-1陽性細(xì)胞呈棕黃色，在空白對照組、大平臺對照組可見淡棕黃色I(xiàn)ba-1陽性細(xì)胞，具有分枝狀細(xì)小突起；慢性睡眠剝奪組可見Iba-1陽性細(xì)胞呈深棕色，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞突起增多且分枝增多，細(xì)胞數(shù)量增多，與空白對照組、大平臺對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，圖1,表1)；丁苯酞干預(yù)組Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量較慢性睡眠剝奪組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1,表1)。

Fig. 1 The immunohistochemical expressions of Iba-1 in frontal lobe of rats in control group (A and E), platform group (B and F), chronic sleep deprivation group (C and G) and butylphthalide intervention group (D and H)

2.2 丁苯酞對慢性睡眠剝奪大鼠額葉iNOS、Arg1表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，慢性睡眠剝奪組大鼠額葉iNOS表達(dá)增加，與空白對照組、大平臺對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，圖2,表1), 丁苯酞干預(yù)組iNOS表達(dá)較慢性睡眠剝奪組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2,表1)。慢性睡眠剝奪組大鼠額葉Arg1表達(dá)較空白對照組、大平臺對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，圖2,表1)，而丁苯酞干預(yù)組Arg1表達(dá)較空白對照組、大平臺對照組減少(P<0.05),但與慢性睡眠剝奪組比較無顯著差異。

2.3 丁苯酞對慢性睡眠剝奪大鼠額葉炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

各組相對于空白對照組的相對表達(dá)量見表2。慢性睡眠剝奪組大鼠額葉IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)升高，與空白對照組和大平臺對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。丁苯酞干預(yù)組大鼠額葉IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)較慢性睡眠剝奪組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

Tab. 1 Number of Iba-1 positive cells and relative expression of iNOS and Arg-1 in four groups n=4)

Tab. 2 Relative mRNA expressions of IL-1, IL-6 and TNF-α in four groups n=4)

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有膠質(zhì)細(xì)胞的5%，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對各種病理刺激，如外傷[14]、缺血[15]的早期反應(yīng)。Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，我們的研究發(fā)現(xiàn)慢性睡眠剝奪大鼠腦內(nèi)Iba1陽性細(xì)胞增加、染色加深且細(xì)胞體肥大伴細(xì)胞突起增多，提示睡眠剝奪可導(dǎo)致腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化。此外，我們的研究還表明丁苯酞使慢性睡眠剝奪大鼠腦內(nèi)Iba1陽性細(xì)胞減少，提示丁苯酞可抑制睡眠剝奪所致的腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可分為兩種主要類型：經(jīng)典激活狀態(tài)(M1型)和替代激活狀態(tài)(M2型)。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生促炎因子、炎癥介質(zhì)等，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，從而促進(jìn)組織炎癥和損傷。相反,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎介質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子,如轉(zhuǎn)變生長因子β等，促進(jìn)組織修復(fù)和減輕腦損害[16]。iNOS是M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，而Arg1則是M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。 在本實驗中，我們觀察到睡眠剝奪可導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)iNOS表達(dá)增加，而Arg1表達(dá)減少，這說明慢性睡眠剝奪導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞增多而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞減少，從而促進(jìn)組織炎癥。M1和M2表型是小膠質(zhì)細(xì)胞的不同活化狀態(tài)，是一系列激活狀態(tài)譜的兩個極端，而不是單個細(xì)胞表型[17]。小膠質(zhì)細(xì)胞具有高度的可塑性，可在不同表型之間快速轉(zhuǎn)化[18]。在本實驗中，當(dāng)對慢性睡眠剝奪大鼠給予丁苯酞干預(yù)后，iNOS表達(dá)減少而Arg1改變不明顯，提示腦內(nèi)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞減少而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞無改變，這說明丁苯酞可抑制慢性睡眠剝奪后腦內(nèi)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞但并不增加M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。與我們的研究結(jié)果相類似，已有動物研究表明丁苯酞可減少腦缺血后的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞[19]。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的減少會緩解促炎因子及炎癥介質(zhì)的釋放，有助于減輕組織炎癥和損傷。

M1型小膠質(zhì)細(xì)胞會生成多種具有神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，并經(jīng)特定受體及信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮炎癥介質(zhì)作用。本實驗中，慢性睡眠剝奪大鼠腦內(nèi)檢測到增加的IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA，提示慢性睡眠剝奪導(dǎo)致腦部炎癥反應(yīng)，這與既往的研究一致[4, 5]。研究已表明，神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退性行疾病的一個突出特征和潛在的貢獻(xiàn)者，過度生成促炎細(xì)胞因子會導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的惡性循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致慢性神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[20],這說明慢性睡眠剝奪可能增加神經(jīng)退行性變的發(fā)生。另外，我們還發(fā)現(xiàn)丁苯酞干預(yù)可使慢性睡眠剝奪后腦部炎癥因子減少，說明丁苯酞可以通過減少M1型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎癥因子而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜合我們的研究結(jié)果，丁苯酞可抑制慢性睡眠剝奪導(dǎo)致的大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少炎癥因子生成，為神經(jīng)炎癥的治療提供新的策略。