霍海燕， 王 瑾， 張?jiān)S梅， 張文婷， 岳繼萍， 焦向英

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系， 太原 030001)

糖尿病發(fā)病率及其死亡率的迅速上升，已威脅人類健康。調(diào)查結(jié)果顯示，糖尿病與年齡密切相關(guān)，60歲以上老年人患病率較高[1]。糖尿病及其伴隨的代謝紊亂也會(huì)促進(jìn)胰島β細(xì)胞的衰老[2]。近年來，關(guān)于胰島β細(xì)胞衰老在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注，清除衰老細(xì)胞和改善衰老細(xì)胞的微環(huán)境有望成為糖尿病治療方式之一[3, 4]。但糖尿病是否會(huì)引起胰島β細(xì)胞衰老，通過哪種機(jī)制影響尚不清楚。

研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的重要原因之一[5]。在氧化應(yīng)激過程中，硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)發(fā)揮減少氧化蛋白和清除自由基的作用。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein, TXNIP)，是唯一的Trx內(nèi)源性結(jié)合抑制蛋白，抑制其活性，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[6]。有研究表明，TXNIP在糖尿病患者和糖尿病模型小鼠中β細(xì)胞的表達(dá)均顯著上調(diào)，抑制 TXNIP的表達(dá)可以減輕減緩糖尿病的發(fā)生發(fā)展[7]?；诖耍狙芯恐靥接懱悄虿∫鸬腡XNIP表達(dá)上調(diào)對(duì)胰島β細(xì)胞衰老的影響及作用機(jī)制，為治療糖尿病尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

db/dbⅡ型糖尿病小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所；INS-1胰島β細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)。慢病毒載體：pLV[shRNA]-mCherry: T2A: Puro-U6>Scramble shRNA，載體編號(hào)：VB15104-10082，滴度1.76×108TU/ml；pLV[shRNA]-mCherry: T2A: Puro-U6>rTXNIP[shRNA#10]，載體編號(hào)：VB171229-1093rwb，滴度3.02×108TU/ml；pLV[shRNA]-mCherry: T2A: Puro-U6>rTXNIP[shRNA#5]，載體編號(hào)：VB171229-1092cxv，滴度 7.95×108TU/ml；pLV[shRNA]-mCherry: T2A: Puro-U6>rTXNIP[shRNA#1]，載體編號(hào)：VB171229-1090mfe，滴度1.76×108TU/ml；pLV[Exp]-EGFP: Puro-Null，載體編號(hào)：VB160420-1011mqh，滴度2.02×108TU/ml；pLV[Exp]-EGFP: Puro-EF1A>rTXNIP[NM-001008767.1]，載體編號(hào)：VB170607-1127nqq，滴度6.22×108TU/ml。由廣州賽業(yè)公司包裝完成。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 購(gòu)自北京賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司，RNA提取盒(Code No.9109)購(gòu)自TAKARA公司，β -半乳糖苷酶染色試劑盒(ab102534)、兔抗大鼠TXNIP抗體(ab188865)、兔抗大鼠p16抗體(ab51243)、兔抗大鼠p21抗體(ab109199)購(gòu)自Abcam公司，小鼠抗大鼠Rb抗體(GTX20024)購(gòu)自GENETRX公司。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染INS-1胰島β細(xì)胞

選擇覆蓋率80%～90%且狀態(tài)良好的INS-1胰島β細(xì)胞，用1 ml PBS洗3次。各組病毒各取30 μl分別加入到1 ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基。Normal組直接加入1 ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基，Scramble ShRNA組(干擾空病毒組)、TXNIP-ShRNA-1(TXNIP沉默一組)組、TXNIP-ShRNA-2(TXNIP沉默二組)組、TXNIP-ShRNA-3組(TXNIP沉默三組)、Ad-GFP組(過表達(dá)空病毒組)、Ad-TXNIP-GFP組(TXNIP過表達(dá)組)分別加入病毒液。慢病毒轉(zhuǎn)染4～6 h后，棄去含病毒的培養(yǎng)基，1 ml PBS洗3次，各組加4 ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，加入含3 μg/ml嘌呤霉素(puromycin, PM)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，維持7 d，每2～3 d更換新的篩選培養(yǎng)基，運(yùn)用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)細(xì)胞熒光率達(dá)90%以上時(shí)，各組換回正常RMPI 1640完全培養(yǎng)基，穩(wěn)轉(zhuǎn)TXNIP沉默和過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)TXNIP mRNA表達(dá)量

收集細(xì)胞至離心管，1 500 r/min，5 min離心，棄上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取、cDNA合成、Real-time PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)，用 2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)量。TXNIP 上游引物序列為 5’-AGTGATTGGCAGCAGGTC-3’，下游引物序列為 5’-GGTGTCTGGGATGTTTAGG-3’；GAPDH上游引物序列為5’-ATGGTGAAG GTCGGTGTG-3’，下游引物序列為 5’-AACTTGCCGTGGGTAGAG-3’。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量

收集各組細(xì)胞至離心管，4 000 r/min，離心5 min，棄上清得到細(xì)胞沉淀，每管加入100 μl裂解液和1 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等質(zhì)量蛋白于SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，與一抗反應(yīng)4℃過夜[各種抗體稀釋度為TXNIP(1∶1 000)、p16(1∶1 000)、p21(1∶1 000)、Rb(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)]，與二抗反應(yīng)2 h，曝光。使用Image J 進(jìn)行分析，得到條帶灰度值，并將目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值進(jìn)行對(duì)比，得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 β -半乳糖苷酶染色

將各組細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 ml，24 h后吸出上清(胰腺組織冰凍切片)，PBS洗3次，加入1 ml β -半乳糖苷酶染色固定液室溫靜置15 min，PBS洗3次，吸出固定液，加入1 ml染色工作液，封口膜密封6孔板，置于無CO2的37℃孵箱中過夜，普通光學(xué)顯微鏡觀察，衰老細(xì)胞在β-半乳糖酶催化下表達(dá)藍(lán)色產(chǎn)物。

1.6 細(xì)胞免疫熒光

重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24 h，取出6孔板，吸出上清液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，吸出多聚甲醛，PBS洗3次，0.05% Triton-100(PBS配置)1 min，PBS洗3次，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，PBS洗3次，每個(gè)玻片滴加足夠量的一抗[TXNIP(1∶250)、p16(1∶100)、p21(1∶400)、Rb(1∶500)]，室溫孵育2 h，PBS洗3次，各孔滴加稀釋好的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，在玻片上滴加1滴DAPI，取另一蓋玻片，小心蓋于原蓋玻片上，避光孵育5 min，運(yùn)用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖尿病對(duì)小鼠空腹血糖和胰腺組織TXNIP表達(dá)的影響

如結(jié)果所示，與正常小鼠相比，db/db組小鼠空腹血糖顯著上升(表1，P<0.01)，胰腺組織TXNIP蛋白表達(dá)顯著升高(表1、圖1，P<0.05)。以上結(jié)果表明，糖尿病小鼠構(gòu)建成功，且糖尿病可使胰腺組織中TXNIP表達(dá)升高。

Tab. 1 Effects of diabetes on fasting blood glucose and pancreatic tissue TXNIP protein expression in n=6)

Fig. 1 Effect of diabetes on the expression of TXNIP protein in pancreatic tissue (n=6)

2.2 糖尿病對(duì)小鼠胰腺組織衰老的影響

如結(jié)果所示，與正常小鼠相比，db/db組小鼠胰腺組織陽(yáng)性染色率增加(圖2)，p16、p21、Rb蛋白表達(dá)顯著升高(表2、圖3，P<0.05)。以上結(jié)果表明糖尿病小鼠中可能存在胰島β細(xì)胞的衰老。

Fig. 2 SA-β-gal staining in pancreas of db/db mice(scale bar=100 μm)

Tab. 2 Effects of diabetes on the expressions of p16, p21 and Rb protein in pancreatic n=6)

Fig. 3 Effects of diabetes on the expressions of p16, p21 and Rb protein in pancreatic tissues

2.3 TXNIP過表達(dá)對(duì)小鼠INS-1胰島β細(xì)胞衰老的影響

結(jié)果如圖顯示，Ad-GFP組、Ad-TXNIP-GFP組，各組病毒轉(zhuǎn)染INS-1胰島β細(xì)胞48 h后，均用嘌呤霉素(puromycin, PM)篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察構(gòu)建成功的細(xì)胞株(圖4，見彩圖頁(yè)Ⅰ)。與Ad-GFP組相比，Ad-TXNIP-GFP組TXNIP的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(表3、圖5，P<0.01)。以上結(jié)果表明，慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)TXNIP過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

結(jié)果如圖顯示，與Ad-GFP組相比，Ad-TXNIP-GFP組陽(yáng)性染色率增加(圖6)。Western blot顯示，與Ad-GFP組相比，Ad-TXNIP-GFP組p16、p21、Rb蛋白表達(dá)均顯著增加(表4、圖7，P<0.01)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與Western blot結(jié)果一致(圖8，見彩圖頁(yè)Ⅰ，圖9，圖10，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。以上結(jié)果表明，TXNIP過表達(dá)可增加p16、p21、Rb蛋白表達(dá)，促進(jìn)衰老。

Tab. 3 Expression of TXNIP mRNA and protein in INS-1 cells n=6)

Fig. 5 Expression of TXNIP protein in INS-1 cells

Fig. 6 SA-β-gal staining in INS-1 cells after lentivirus stable transfection(scale bar=50 μm)

Tab. 4 Effect of overexpression of TXNIP on expression of p16, p21 and Rb proteins in INS-1 cells ( n=6)

Fig. 7 Effect of overexpression of TXNIP on the expressions of p16, p21 and Rb proteins in INS-1 cells

2.4 TXNIP沉默對(duì)INS-1胰島β細(xì)胞衰老的影響

我們采用與過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系一致的方法建立TXNIP沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)INS-1胰島β細(xì)胞株。熒光顯微鏡下觀察構(gòu)建成功的細(xì)胞株(圖11，見彩圖頁(yè)Ⅲ)。篩選有效TXNIP沉默序列，與Scramble ShRNA組相比，第三條干擾序列效果最佳，其TXNIP的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(表5、圖12，P< 0.01)。以上結(jié)果表明，慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)TXNIP沉默細(xì)胞株構(gòu)建成功。

結(jié)果如圖顯示，將TXNIP沉默后，發(fā)現(xiàn)與Scramble ShRNA組相比，TXNIP-ShRNA組β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性染色率降低(圖13)，p16、p21以及Rb蛋白表達(dá)均降低(表6、圖14，P<0.05)，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與Western blot結(jié)果一致(圖15，見彩圖頁(yè)Ⅲ，圖16，圖17見彩圖頁(yè)Ⅳ)。以上結(jié)果表明，TXNIP沉默后，可抑制INS-1胰島β細(xì)胞的衰老。

Tab. 5 Expressions of TXNIP mRNA and protein in INS-1 cells n=6)

Fig. 12 Expression of TXNIP protein in INS-1 cells

Fig. 13 SA-β-gal staining in INS-1 cells after lentivirus stable transfection(scale bar=50 μm)

Tab. 6 Effect of silencing of TXNIP on expression of p16, p21 and Rb proteins in INS-1 cells n=6)

Fig. 14 Effect of silencing of TXNIP on the expressions of p16, p21 and Rb proteins in INS-1 cells

3 討論

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題[8]。在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中，胰島β細(xì)胞的損傷，衰老和數(shù)量下降，是糖尿病發(fā)生并不斷惡化的主要原因，因此抑制胰島β細(xì)胞凋亡和衰老，促進(jìn)β細(xì)胞的增生代償，是治療糖尿病的關(guān)鍵。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein, TXNIP)可抑制硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)活性促進(jìn)氧化應(yīng)激[7, 9]，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、衰老。通過課題組之前的研究表明，糖尿病可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞TXNIP的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡和增殖[10]。同時(shí)也有研究表明，TXNIP可通過抑制Trx活性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老[11]。因此，推測(cè)糖尿病通過上調(diào)TXNIP表達(dá)，引起胰島細(xì)胞衰老，這也可能為治療糖尿病提供新的理論和方法。

細(xì)胞衰老的生物學(xué)特征有生長(zhǎng)停滯、β半乳糖苷酶表達(dá)增加，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的基因在胞內(nèi)積累等[12, 13]。β半乳糖苷酶作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志物之一，在衰老細(xì)胞處于酸性條件時(shí)，細(xì)胞內(nèi)源性β半乳糖苷酶活性增加，本課題采用的試劑盒以X-gal為底物，通過原位染色，衰老細(xì)胞在衰老特異性β-半乳糖酶催化下表達(dá)藍(lán)色產(chǎn)物[14]。同時(shí)由文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞衰老導(dǎo)致的生長(zhǎng)停滯與p53/p21和p16/Rb兩條信號(hào)通路有關(guān)[12]。因此本課題組通過db/m小鼠和db/db小鼠比較，探討糖尿病與TXNIP和衰老的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠TXNIP蛋白表達(dá)明顯升高，β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率增加，p16、p21、Rb蛋白表達(dá)顯著升高。提示糖尿病促進(jìn)TXNIP的表達(dá)，且糖尿病小鼠中胰島β細(xì)胞衰老明顯升高。而TXNIP是否參與糖尿病誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞衰老的過程？

本研究中采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了TXNIP過表達(dá)及沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型，通過熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株，初步確定病毒轉(zhuǎn)染成功，通過PCR和Western blot的結(jié)果進(jìn)一步確定慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)TXNIP過表達(dá)和沉默細(xì)胞株構(gòu)建成功。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TXNIP過表達(dá)組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率增加，p16、p21、Rb蛋白表達(dá)均顯著增加；TXNIP沉默組，β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率降低，p16、p21、Rb蛋白表達(dá)均顯著降低，提示TXNIP可通過影響p16、p21、Rb表達(dá)，引起胰島β細(xì)胞衰老。綜上所述，糖尿病可促進(jìn)TXNIP的表達(dá)，促進(jìn)p16、p21、Rb表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰島細(xì)胞衰老。因此可以通過影響H2O2[15]，胰島素，炎性因子等各種因素來減少TXNIP生成，減輕糖尿病時(shí)胰島β細(xì)胞的衰老，延緩改善繼發(fā)的胰島素分泌和代償不足和糖尿病的進(jìn)展。