趙 洋， 楊勝昌， 于富洋， 李文雅， 吉恩生

(河北中醫(yī)學院生理教研室， 石家莊 050200)

阻塞性呼吸睡眠暫停(obstructive sleep apnea，OSA)是一個由睡眠期間上呼吸道反復塌陷導致的睡眠障礙疾病，表現(xiàn)為打鼾、睡眠片段化、日間乏力、嗜睡等[1]。流行病學報道稱15%～24%的成年人存在不同程度的OSA，在一項5年的隨訪中，OSA患者罹患癡呆的風險是非OSA患者的1.7倍[2,3]。臨床研究還發(fā)現(xiàn)OSA患者存在明顯的注意力下降以及學習和記憶能力損傷，嚴重影響日常的學習和工作[4]。我們先前的動物模型結(jié)果也表現(xiàn)出顯著的行為學成績下降[5]。慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)是OSA最主要的病理特征，有研究表明長期的低氧/復氧可能是導致認知障礙的主要原因[6]。海馬功能和結(jié)構(gòu)的完整性對于學習和記憶具有至關(guān)重要的作用[7]。CIH暴露可破壞海馬神經(jīng)元和突觸結(jié)構(gòu)的完整性，導致突觸后致密物質(zhì)受損和突觸素丟失，影響神經(jīng)元之間的信息傳遞，損害學習和記憶功能[8,9]。

臨床上針對OSA的治療方法主要有持續(xù)正壓通氣，口腔矯正以及手術(shù)治療等，但依然存在治療反復、患者依從性差等問題。相比之下，傳統(tǒng)醫(yī)學具有簡便效廉的特點。據(jù)我們先前的研究結(jié)果表明，消痰化瘀利竅方對CIH誘導的大鼠心功能不全具有良好的改善作用[10]。本研究通過建立CIH小鼠模型，明確消痰化瘀利竅方對CIH誘導的小鼠認知障礙的改善作用，探討復方對CIH暴露小鼠海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)損傷以及突觸相關(guān)蛋白表達的作用機制。本研究以O(shè)SA患者“痰、虛、瘀”中醫(yī)辨證為基礎(chǔ)，以期尋求改善慢性間歇性低氧誘發(fā)認知障礙的新措施。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性C57小鼠48只，體重20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。隨機平均分成四組(n=12)：常氧對照組(Normoxia)，慢性間歇性低氧組(CIH)、慢性間歇性低氧中藥干預組(Formula+CIH)、中藥對照組(Formula)。將CIH及Formula+CIH組暴露于動物慢性間歇性低氧裝置，前1.5 min向艙內(nèi)充入100%氮氣使O2濃度降至9%，后1.5 min充入醫(yī)用氧(>99.5%)使O2濃度升至21%，每一循環(huán)3 min，每天8: 00 am-4: 00 pm上艙8 h，共35 d。Normoxia及Formula組大鼠置于低氧艙內(nèi)，但向艙內(nèi)充入空氣。同時，F(xiàn)ormula+CIH與Formula組于每天8: 00前灌胃前Formula+CIH與Formula組給予消痰化瘀利竅方灌胃(生藥量26.8 g/kg以中藥藥理研究方法學的小鼠與人藥物劑量折算方法折算臨床劑量)，CIH與Normoxia組灌服同體積生理鹽水。各組小鼠于造模26～35 d進行水迷宮實驗，35 d造模結(jié)束后應用Y-迷宮進行行為學測定，然后斷頭分離海馬組織，部分用多聚甲醛固定，用于尼氏染色和透射電鏡觀察結(jié)構(gòu)變化，另一部分凍存于-80℃冰箱用于Western blot檢測蛋白表達情況。

1.2 主要試劑與儀器

消痰化瘀利竅方由丹參30 g，法半夏12 g，陳皮10 g，茯苓15 g，生黃芪15 g，炒白術(shù)12 g，石菖蒲12 g，郁金12 g，射干12 g，白芥子10 g，桔梗12 g，枳殼15 g，川芎12 g，赤芍15 g，地龍12 g組成，以水煮醇沉法制備,含生藥1.1 g/ml，中藥材購自于神威藥業(yè)集團有限公司；尼氏染色液和電鏡專用2.5%戊二醛固定液(武漢塞維爾生物科技有限公司)；synapsin(proteintech，17785-1-AP)和PSD-95抗體(Servicebio，GB11277)；β-Tubulin(Servicebio，GB13017-2)；HRP標記山羊抗兔IgG(Servicebio，GB23303)和HRP標記山羊抗小鼠IgG(Servicebio，GB23301)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀，CW0014S)。動物間歇性低氧裝置(Oxycycler Model A84, BioSpherix)。

1.3 Morris水迷宮實驗

于造模26～35 d進行連續(xù)10 d的水迷宮行為學檢測，包括定向航行實驗和空間探索實驗。第1～5日進行隱藏平臺實驗(hidden platform training)，每只小鼠大鼠每天訓練4次，分別從4個不同入水點面壁入水，記錄分析小鼠在訓練期間找到平臺的時間( 潛伏期)；第6日撤去平臺進行第1次空間探索實驗，記錄小鼠60 s 內(nèi)于原平臺所在象限的探索時間百分比。第7～9日進行反轉(zhuǎn)平臺實驗(reversal platform training)，第10日撤去平臺進行第2次空間探索實驗。同時，進行可見平臺實驗，以排除小鼠的游泳能力和視力對行為學的影響。

1.4 Y-迷宮實驗

造模結(jié)束后，進行Y-迷宮行為學測定。Y-迷宮由一個中心區(qū)域和周圍連接的三條完全相同的封閉臂組成，三臂互為120°角，呈三等分輻射狀。將三臂分別命名為A，B和C，將每只小鼠放于中心區(qū)域，允許小鼠自由探索5 min。計錄5 min內(nèi)小鼠進入三條臂的總次數(shù)以及正確次數(shù)(連續(xù)三次進入無重復臂)，以正確次數(shù)評價動物的Y-迷宮成績。

1.5 組織病理學觀察

造模結(jié)束后，取出大腦并用4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，進行尼氏染色。分離海馬組織置于2.5%戊二醛溶液中，包埋、切片，于電鏡下觀察突觸后致密物質(zhì)的厚度。

1.6 Western blot檢測synapsin和PSD-95的表達

分離海馬組織，按100 mg/ml加入蛋白裂解液，超聲破碎后，離心(12 000 r/min,15 min,4℃)取上清，BCA測定蛋白濃度。蛋白變性后，-80℃保存待用。電泳(80 V，40 min；160 V，90 min)結(jié)束后，進行半干轉(zhuǎn)(22 V，28 min)。5%脫脂牛奶封閉120 min,TBST清洗三次，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日，TBST清洗三次，加入相應二抗(1∶ 5 000)孵育120 min。TBST清洗三次后，應用ECL發(fā)光顯色并拍照。采用Quantity One分析軟件進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 消痰化瘀利竅方對CIH小鼠水迷宮成績的影響

水迷宮實驗結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對照組小鼠水迷宮的成績無明顯變化，CIH組小鼠在隱藏平臺和反轉(zhuǎn)平臺實驗中的潛伏期明顯延長(P<0.01，P<0.01)，在空間探索實驗中的目標象限時間百分比明顯下降(P<0.01，P<0.01)，提示CIH可誘導小鼠學習和記憶能力明顯下降。而消痰化瘀利竅方干預能明顯提高CIH小鼠的水迷宮成績(P<0.01，圖1，表1)。

Fig. 1 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on Morris water maze performance in mice exposed to CIH

Tab. 1 Time spent in the target quadrant in the probe test (s, n=6)

2.2 消痰化瘀利竅方對CIH小鼠Y-迷宮成績的影響

Y-迷宮實驗結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對照組小鼠對Y-迷宮的成績無明顯變化，CIH組小鼠總進臂次數(shù)無明顯變化，但是正確次數(shù)明顯下降(P<0.01)，而消痰化瘀利竅方干預能明顯增加CIH小鼠的正確次數(shù)(P<0.01，表2) 。

2.3 消痰化瘀利竅方對CIH小鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

尼氏染色結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對照組海馬尼氏小體數(shù)量無明顯變化，CIH組小鼠海馬神經(jīng)元染色變淺，尼氏小體數(shù)量減少。與CIH組相比，消痰化瘀利竅方干預可減輕海馬神經(jīng)元的損傷(圖2)。

Tab. 2 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on Y-maze performance in mice exposed to CIH n=6)

Fig. 2 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on hippocampal neuron injury in mice exposed to CIH(Nissl staining ×400)

2.4 消痰化瘀利竅方對CIH小鼠突觸后致密物厚度的影響

電鏡結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對照組突觸后致密物質(zhì)的厚度無明顯變化，CIH組小鼠海馬神經(jīng)元突觸后致密物質(zhì)厚度減少，而消痰化瘀利竅方干預可明顯增加突觸后致密物厚度(圖3)。

Fig. 3 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on postsynaptic density thickness in mice exposed to CIH(Transmission Electron Microscope ×25 000)

2.5 消痰化瘀利竅方對CIH小鼠海馬神經(jīng)元synapsin和 PSD-95水平的影響

與Normoxia組相比，中藥對照組海馬synapsin和 PSD-95的表達無明顯變化，CIH組小鼠PSD-95水平顯著降低(P<0.01)，消痰化瘀利竅方干預可明顯上調(diào)PSD-95的表達，與CIH組大鼠相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而synapsin蛋白的表達在各組之間無明顯差異(圖4，表3)。

Fig. 4 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on synapsin and PSD-95 expressions in hippocampus

Tab. 3 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on synapsin and PSD-95 expressions in hippocampus n=6)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，在發(fā)達國家和發(fā)展中國家有5%～7%的人群患有OSA，而在臨床上超過70%的OSA患者表現(xiàn)出認知障礙，如學習和記憶功能受損等[11,12]。研究表明，大腦遭受長期的低氧/復氧可造成海馬神經(jīng)元的喪失[13]，影響突觸可塑性，進而引起記憶能力減退和認知功能障礙。本研究通過建立CIH小鼠模型評估其行為學的改變，觀察形態(tài)學以及相關(guān)的分子表達。發(fā)現(xiàn)在CIH暴露后，小鼠水迷宮和Y-迷宮成績明顯下降，尼氏染色顯示海馬神經(jīng)元染色變淺，電鏡觀測可見突觸后致密物減少，Western結(jié)果顯示PSD-95表達明顯減少。而給予消痰化瘀利竅方干預可明顯改善CIH 誘導小鼠的認知障礙以及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的損傷。

水迷宮通常用于評估空間參考記憶和學習功能。與以往研究一致[5]，我們發(fā)現(xiàn)慢性間歇性低氧暴露小鼠在目標象限停留時間減少和逃避潛伏期時間延長。消痰化瘀利竅方干預可明顯提高CIH小鼠的水迷宮成績。由于工作記憶是記憶執(zhí)行的重要組成部分，聯(lián)合應用Y-迷宮評估小鼠認知功能的影響將更為客觀。結(jié)果顯示，消痰化瘀利竅方干預可明顯增加CIH小鼠在Y-迷宮中的正確進臂次數(shù)。提示，消痰化瘀利竅方可以改善CIH誘導的學習和記憶功能障礙。中醫(yī)學認為心與神志密不可分，《素問·靈蘭秘典論》曰“心者，君主之官，神明出焉”。而《素問·脈要精微論》中提出“頭者，精明之府”，《本草備要》也提到“人之記性，皆在腦者”。又把腦與神志、記憶功能聯(lián)系起來。同時，腦為髓海，心主血脈而藏神，由于精血同源，腦髓與心血互相滋養(yǎng)，正如孫沛所言“故性動而靈，腦賴心血養(yǎng)之”[14]。所以祖國醫(yī)學在治療精神以及認知疾病時常用養(yǎng)血補心，豁痰通竅的方法[15]。消痰化瘀利竅方具有活血祛瘀，豁痰通竅的功效，對于慢性間歇性低氧引起的認知功能障礙恰合病機。

海馬是學習和記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，尤其對睡眠期間長時間的低氧/復氧非常敏感，該腦區(qū)神經(jīng)元的損傷可導致嚙齒動物出現(xiàn)顯著的認知缺陷[7,16]。我們通過尼式染色結(jié)果觀測到消痰化瘀利竅方可改善CIH暴露后的海馬神經(jīng)元損傷。突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)是突觸后膜的一層均質(zhì)致密物，是反映突觸可塑性的形態(tài)學參數(shù)[17]。我們應用透射電鏡觀測到CIH組小鼠海馬神經(jīng)元突觸后致密物厚度明顯低于對照組，而消痰化瘀利竅方干預可明顯增加突觸后致密物厚度。由此可見，消痰化瘀利竅方可能通過改善海馬神經(jīng)元損傷進而發(fā)揮對CIH誘導認知功能障礙的保護作用。

PSD-95是突觸后致密區(qū) (PSD) 的一種重要的神經(jīng)細胞骨架蛋白，可以與離子通道，膜受體和細胞內(nèi)信號分子等相互作用，調(diào)節(jié)突觸可塑性[18]。Ehrlich I[9]等認為，在學習期間PSD-95表達水平在突觸位點特異性的增加誘導了突觸可塑性的升高。而 PSD-95表達水平下降則與認知障礙密切相關(guān)[19]。本實驗結(jié)果顯示CIH暴露可導致PSD-95表達下調(diào)，而對突觸素的表達無明顯影響。消痰化瘀利竅方干預可明顯上調(diào)CIH暴露小鼠PSD-95的表達水平。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)單獨給予消痰化瘀利竅方對小鼠的學習記憶能力以及突觸可塑性無明顯作用，也不影響synapsin和PSD-95蛋白的表達。提示消痰化瘀利竅方對正常小鼠的學習記憶功能無明顯影響。消痰化瘀利竅方是通過上調(diào)CIH誘導的PSD-95表達下降改善CIH 誘導海馬神經(jīng)元突觸后可塑性下降，進而改善CIH暴露小鼠的認知功能障礙。

綜上，消痰化瘀利竅方干預可通過增加突觸后致密物質(zhì)厚度以及上調(diào)PSD-95蛋白的表達水平，改善CIH誘導的認知功能障礙。而針對OSA“痰、虛、瘀”的中醫(yī)病機[20]，通過活血祛瘀，豁痰通竅的治法，可為臨床改善OSA誘發(fā)認知功能障礙的中醫(yī)藥防治提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。