戴剛，朱榮華，龔慶豪，蔡一亭

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院胃腸外科，上海202150

結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時增加患者的遠(yuǎn)期預(yù)后惡化風(fēng)險及病死率[1‐2]。近年來結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且在具有腸道息肉家族史的人群中，其發(fā)病率較高。臨床上越來越多的研究關(guān)注分子改變對結(jié)腸癌的影響。研究表明，RNA結(jié)合蛋白Musashi 1能夠通過影響轉(zhuǎn)錄RNA的功能狀態(tài)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)蛋白的活性發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞異常分裂[3]。微小RNA‐132（microRNA‐132，miRNA‐132）可通過參與結(jié)腸癌細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，影響結(jié)腸癌細(xì)胞DNA的合成速度，干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞的復(fù)制及擴(kuò)增[4]。本研究選擇80例結(jié)腸癌組織標(biāo)本和80例癌旁組織標(biāo)本，分析兩種組織中Musashi 1蛋白和miRNA‐132的表達(dá)情況及與患者臨床特征的關(guān)系，旨在為臨床中結(jié)腸癌的診療提供理論參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2018年7月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院接受治療的結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國早期結(jié)直腸癌篩查及內(nèi)鏡診治指南》[5]中結(jié)腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)腸癌；②年齡＜79歲；③接受手術(shù)治療且獲得結(jié)腸癌組織標(biāo)本及其癌旁組織標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②合并免疫系統(tǒng)疾??；③具有放化療史；④術(shù)后復(fù)發(fā)性結(jié)腸癌。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入80例結(jié)腸癌患者?；颊叩哪挲g為35～78歲，平均（53.0±12.4）歲；男47例，女33例；TNM分期：I期24例，Ⅱ期30例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例；組織分化程度：低分化27例，中分化20例，高分化33例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例；浸潤深度：侵及漿膜33例，未侵及漿膜47例。收集結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織標(biāo)本80例及其癌旁組織標(biāo)本80例。

1.2 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA-132的相對表達(dá)量

采用組織研磨的方法提取組織中的RNA，在無酶的操作條件下加入焦炭酸二乙酯，測量RNA濃度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行基因擴(kuò)增。采用primer 5軟件設(shè)計(jì)的miRNA‐132引物，采用甘油醛‐3‐磷酸脫氫酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate de‐hydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。miRNA‐132上游引物為 5'‐CAAGGACCAACTACAACC‐3'，下游引物為 5'‐TGCCTCTTCTTTAATTG‐3'；GAPDH上游引物為 5'‐CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT‐3'，下游引物為5'‐AGCCTTCTCCATGGTGGT‐GAAGAC‐3'。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain re‐action，PCR）條件：92 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共45個循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA‐132的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測Musashi 1蛋白表達(dá)

將石蠟切片采用二甲苯脫臘至水，應(yīng)用5% H2O2常溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min。應(yīng)用5%的山羊血清抗體封閉10 min，不沖洗，滴加一抗（1∶500），4 ℃冰箱孵育過夜，蒸餾水沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標(biāo)記的二抗（1∶1000），37 ℃孵育30 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min；滴加第二代辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min；顯色之后采用乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片，鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

Musashi 1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，可見黃色、棕黃色、褐色顆粒。依據(jù)染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色或黑色為3分；依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評分：≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞所占比例評分相乘，＜3分為陰性（-），3～5分為弱陽性（+），6～9分為中等陽性（++）；＞9分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中Musashi 1蛋白陽性表達(dá)率的比較

結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白的陽性表達(dá)率為68.75%（55/80），明顯高于癌旁組織的28.75%（23/80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.616，P＜0.01）。（表 1）

表1 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中Musashi 1蛋白的表達(dá)情況

2.2 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中miRNA-132相對表達(dá)量的比較

結(jié)腸癌組織中miRNA‐132的相對表達(dá)量為（0.448±0.104），明顯低于癌旁組織的（2.167±0.551），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.063，P＜0.01）。

2.3 不同臨床特征結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白表達(dá)情況的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及漿膜的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白的陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未侵及漿膜的結(jié)腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同組織分化程度的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.4 不同臨床特征結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中miRNA-132相對表達(dá)量的比較

TNM分期為I～Ⅱ期、高+中分化的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中miRNA‐132的相對表達(dá)量分別明顯高于TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化的結(jié)腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和浸潤深度的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中miRNA‐132的相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表2 不同臨床特征結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白表達(dá)情況的比較（ n=80）

表3 不同臨床特征結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中miRNA‐132相對表達(dá)量的比較（ n=80）

3 討論

高蛋白飲食、吸煙或家族性腸道息肉均能夠促進(jìn)腸道黏膜上皮細(xì)胞的異常病變，增加結(jié)腸癌的發(fā)生風(fēng)險[6‐7]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者的無瘤生存時間不足30個月，隨著時間延長，患者多器官功能衰竭的發(fā)生率明顯上升[8]。對結(jié)腸癌患者的臨床特征進(jìn)行分析具有一定的臨床價值，能夠在結(jié)腸癌的病情評估及預(yù)后預(yù)測方面發(fā)揮作用。雖然糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）和癌胚抗原（car‐cinoembryonic antigen，CEA）等腫瘤標(biāo)志物能夠在結(jié)腸癌的病情評估中發(fā)揮作用，但僅依靠CA125或CEA評估結(jié)腸癌患者的病情可靠性較低[9‐10]。本研究的創(chuàng)新性在于探討了Musashi 1蛋白和miRNA‐132表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系。

miRNA‐132作為非編碼RNA家族成員之一，能夠通過影響細(xì)胞增殖、凋亡及紡錘體的分離等過程，最終影響上皮來源惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生過程。miRNA‐132可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)不同的信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞核DNA分裂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生異型性改變[11]。Musashi 1是一種RNA結(jié)合蛋白，不僅能夠影響miRNA‐132的活性，還能夠通過影響腫瘤細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)第二信使的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞膜上跨膜雙分子蛋白的異常激活，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常。部分研究者探討了miRNA‐132在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中miRNA‐132的表達(dá)水平較低[12‐13]，但缺乏對于Musashi 1表達(dá)情況的分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，miRNA‐132的相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示Musashi 1蛋白和miRNA‐132的異常表達(dá)均可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。Musashi 1蛋白和miRNA‐132表達(dá)水平的改變能夠通過激活結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen‐activated protein kinase，MAPK）信號通路，增加結(jié)腸癌細(xì)胞的浸潤和黏附能力，最終導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的分化成熟障礙，從而參與結(jié)腸癌的病情進(jìn)展。賈偉等[14]研究報道，結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，在中晚期或合并明顯惡病質(zhì)表現(xiàn)的結(jié)腸癌患者中，Musashi 1蛋白的陽性表達(dá)率更高。本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及漿膜的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白的陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未侵及漿膜的結(jié)腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示Musashi 1蛋白的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者的臨床特征具有密切關(guān)系，這主要是由于Musashi 1蛋白的表達(dá)水平升高可增加結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的浸潤能力，促進(jìn)其對結(jié)腸肌層組織或結(jié)腸引流部位淋巴結(jié)的浸潤，最終促進(jìn)病情進(jìn)展[15]。本研究結(jié)果還顯示，TNM分期為I～Ⅱ期、高+中分化的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中miRNA‐132的相對表達(dá)量分別明顯高于TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化的結(jié)腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明miRNA‐132也能夠影響結(jié)腸癌患者的病情進(jìn)展，這主要是由于miRNA‐132的表達(dá)水平下降能夠通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)多種腫瘤相關(guān)效應(yīng)因子的激活，進(jìn)而影響結(jié)腸癌患者的病情。但本研究未發(fā)現(xiàn)miRNA‐132表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，表明miNA‐132表達(dá)水平的改變并不影響結(jié)腸癌細(xì)胞對淋巴結(jié)組織的黏附過程。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中Musashi 1蛋白表達(dá)上調(diào)，miRNA‐132表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)情況與結(jié)腸癌的惡性程度有關(guān)。但關(guān)于Musashi 1蛋白和miR‐NA‐132表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者臨床預(yù)后或生存轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，仍然需要進(jìn)一步深入研究和探討。