門(mén)桐林，李雪，袁秀敏，張璐

沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院腫瘤科，沈陽(yáng)110044

肺癌是目前世界上發(fā)病率和病死率均較高的 惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的85%，是一種最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型[1]。NSCLC早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者就診時(shí)已為晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。目前放療、化療等治療方法對(duì)晚期NSCLC患者的治療效果不佳，隨著對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制的不斷探索，研究者發(fā)現(xiàn)一些免疫檢查點(diǎn)的負(fù)性調(diào)節(jié)在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2‐3]。 程序性死亡受體 1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD‐1）和程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD‐L1）可以通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)，降低過(guò)度免疫，保護(hù)周?chē)恼＝M織免受損傷，從而增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境對(duì)機(jī)體正常免疫的抵抗作用[4‐6]。PD‐1/PD‐L1 信號(hào)通路在微環(huán)境中能夠誘導(dǎo)NSCLC免疫逃逸機(jī)制的產(chǎn)生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的殺傷作用，并在機(jī)體其他組織器官中創(chuàng)造腫瘤微環(huán)境，為腫瘤的擴(kuò)散提供條件[7‐8]。目前PD‐1/PD‐L1信號(hào)通路成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，PD‐1/PD‐L1信號(hào)通路阻滯劑抗PD‐1和抗PD‐L1抗體能夠逆轉(zhuǎn)NSCLC免疫逃逸，殺死腫瘤細(xì)胞。本研究主要探討PD‐1和PD‐L1在NSCLC組織中的表達(dá)情況及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2015年1月至2017年1月沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院收治的150例NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為NSCLC；②首次診斷并接受外科手術(shù)治療；③未接受過(guò)放療、化療及其他免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾??；②合并嚴(yán)重的心血管疾病或心腎功能不全；③合并感染等并發(fā)癥；④不配合治療。150例NSCLC患者中，男80例，女70；年齡26～67歲，平均（49.41±2.83）歲；病理類(lèi)型：鱗狀細(xì)胞癌30例，腺癌88例，腺鱗癌32例。收集患者的NSCLC組織及其癌旁組織（距腫瘤邊緣3 cm內(nèi)）各150例，所有標(biāo)本取得后立刻放入液氮罐中，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)PD- 1和PD-L 1的相對(duì)表達(dá)量

分別取儲(chǔ)存于-80℃冰箱的NSCLC組織及癌旁組織100 mg，利用Trizol法提取RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量與濃度，應(yīng)用1%的核酸膠檢測(cè)RNA的完整性。應(yīng)用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將質(zhì)量較好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用。采用TransStart Top Green qPCR Su‐perMix熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒檢測(cè)兩種組織中PD‐1、PD‐L1的表達(dá)情況。PD-1上游引物為5'‐AGGTGCTGAT‐GGAGAAGGA‐3'，下游引物為5'‐GTGATTG‐CAGCCACGAAC‐3'；PD-L1上游引物為 5'‐AGGT‐GCTGATGGAGAAGGA‐3'，下游引物為 5'‐GT‐GATTGCAGCCACGAAC‐3'。以甘油醛‐3‐磷酸脫氫 酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，其上游引物為 5'‐ACTTCAA‐CAGCGACACCCACT‐3'，下 游引 物 為5'‐GC‐CAAATTCGTTGTCATACCAG‐3'。PCR 反應(yīng)體系（20 μl）：10μmol/L的上下游引物各 0.4μl，模板0.5μl，STBR Premix Ex Taq Mix 10μl，ddH2O 8.7 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s（每次循環(huán)后采集熒光），72℃1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用Bio‐Rad CFX Manager軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)溶解曲線判斷PCR產(chǎn)物的特異性，采用2-△△Ct法計(jì)算PD-1mRNA和PD-L1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法及結(jié)果判定

收集NSCLC組織及癌旁組織，應(yīng)用10%的甲醛固定24 h，石蠟包埋，采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行染色。應(yīng)用冷凍切片機(jī)將制作的石蠟標(biāo)本切割成厚度約為4 μm的切片，將切片置于含多聚賴氨酸的載玻片上進(jìn)行熔蠟，然后將石蠟切片置于60℃烘箱中烘烤120 min進(jìn)行固定。將切片浸泡于二甲苯中10 min，更換二甲苯再浸泡10 min；應(yīng)用無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度脫水：無(wú)水乙醇浸泡10 min，重復(fù)操作1次，95%乙醇浸泡5 min，85%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌水浸泡5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次。加入9%的檸檬酸鈉，高壓加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，降至室溫后應(yīng)用PBS清洗3次，每次5 min。應(yīng)用3% H2O2甲醇溶液室溫孵育10 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，孵育后PBS沖洗3次，每次5 min。切片上滴加10%的山羊血清，37℃封閉20 min。傾倒山羊血清，按照1∶500的比例將PD‐1和PD‐L1抗體稀釋，分別加入組織切片中，4℃恒溫?fù)u床上孵育過(guò)夜，然后應(yīng)用PBS清洗3次，每次5 min。甩干切片，加入1∶1000比例稀釋的羊抗鼠、羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min。應(yīng)用0.04%二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行染色，反應(yīng)部位呈黃褐色時(shí)停止染色，清水沖洗多次，再應(yīng)用蘇木素復(fù)染30 s，清水沖洗3次。經(jīng)85%、95%及100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次5 min，再應(yīng)用二甲苯脫水2次，每次5 min，中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察。每次染色均應(yīng)用山羊血清為一抗作為陰性對(duì)照。由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片。400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜1%為0分，1%～30%為1分，31%～60%為2分，＞60%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加，0～3分為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD 4+-PD- 1、CD 8+-PD- 1、CD14+-PD-L 1、CD68+-PD-L 1的表達(dá)水平

應(yīng)用PBS將收集的NSCLC組織和癌旁組織清洗干凈，將組織剪碎，溶解于Ⅳ型膠原酶中，37℃反應(yīng)1 h。加入1 ml無(wú)血清RPMI‐1640培養(yǎng)基停止組織的溶解，充分研磨。應(yīng)用PBS沖洗，離心取下層沉淀細(xì)胞，應(yīng)用5 ml PBS重懸細(xì)胞，緩慢注入5 ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，保證重懸的細(xì)胞沉淀與Fi‐coll的比例為1.5∶1，采用Ficoll密度梯度離心法，常溫下1800 r/min離心30 min。離心后取中間白膜層，再應(yīng)用PBS沖洗沉淀3次，經(jīng)分離得到外周血單核細(xì)胞，分別加入CD4‐異硫氰酸熒光素（fluo‐rescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、CD8‐FITC、CD14‐FITC、CD68‐FITC、PD‐1‐PE、PD‐L1‐PE抗體，4 ℃恒溫?fù)u床避光孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，上機(jī)檢測(cè)前加入500 μl鞘液。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD- 1、PD-L 1 mRNA表達(dá)情況的比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，NSCLC組織中PD-1mRNA和PD-L1mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（5.03±1.92）和（4.95±1.09），分別高于癌旁組織的（1.72±0.81）和（1.25±0.24），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.454、40.601，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中PD- 1、PD-L 1表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別、病理類(lèi)型、腫瘤直徑的NSCLC患者NSCLC組織中PD‐1和PD‐L1的表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者NSCLC組織中PD‐1的高表達(dá)率均明顯高于TNM分期為I～Ⅱ期、高+中分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.513、10.390、11.918、9.040，P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者NSCLC組織中PD‐L1的高表達(dá)率均明顯高于TNM分期為I～Ⅱ期、高+中分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.266、11.310、28.043、32.344，P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中PD‐ 1、PD‐L 1的表達(dá)情況（ n=150）

2.3CD 4+-PD- 1、CD 8+-PD- 1、CD14+-PD-L 1、CD68+-PD-L 1表達(dá)水平的比較

NSCLC 組織中 CD4+‐PD‐1、CD8+‐PD‐1、CD14+‐PD‐L1、CD68+‐PD‐L1的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 NSCLC組織和癌旁組織中CD 4+‐PD‐ 1、CD 8+‐PD‐ 1、CD14+‐PD‐L 1、CD68+‐PD‐L 1表達(dá)水平的比較（%，± s）

表2 NSCLC組織和癌旁組織中CD 4+‐PD‐ 1、CD 8+‐PD‐ 1、CD14+‐PD‐L 1、CD68+‐PD‐L 1表達(dá)水平的比較（%，± s）

組織類(lèi)型N S C L C組織（n=1 5 0）癌旁組織（n=1 5 0）t值C D 4+‐P D‐1 5 8.3 1±2 8.9 1 4 2.9 3±2 7.5 1 1 3 3.5 9 3 C D 8+‐P D‐1 5 5.9 1±2 7.9 4 4 3.7 2±2 8.9 1 1 8 8.9 8 3 C D 1 4+‐P D‐L 1 5 9.1 5±2 8.7 4 4 4.8 1±3 0.8 1 2 5.6 7 8 C D 6 8+‐P D‐L 1 5 3.7 1±2 5.5 8 4 3.8 2±2 6.9 2 9 0.3 9 3 P值0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 1

3 討論

NSCLC是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率均居全部惡性腫瘤的第1位，預(yù)后較差，已成為威脅人類(lèi)健康的殺手。早期NSCLC的臨床癥狀不明顯，大部分患者確診時(shí)已為中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，放療、化療是中晚期NSCLC患者的主要治療手段。然而放化療具有有效率低、不良反應(yīng)較大等缺點(diǎn)，在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中，腫瘤可以通過(guò)逃避各種免疫監(jiān)視系統(tǒng)完成免疫逃逸，使腫瘤細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)不斷生長(zhǎng)增殖，隨著臨床研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸可以作為治療NSCLC的重要靶點(diǎn)[9‐11]，其在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，該逃逸機(jī)制可為腫瘤的防治提供新方向、新思路。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)在機(jī)體抗腫瘤免疫過(guò)程中扮演著重要的角色[12‐13]。T淋巴細(xì)胞的活化、增殖需要兩重信號(hào)的作用，一方面需要主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）抗原肽復(fù)合物與抗原特異性T細(xì)胞表面受體結(jié)合，另一方面需要協(xié)同刺激分子受體與其配體相互結(jié)合提供正性、負(fù)性信號(hào)作為第二信號(hào)，進(jìn)而精確參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[14‐15]。PD‐1是一種常見(jiàn)的負(fù)性協(xié)同刺激分子，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞表面，通過(guò)與PD‐L1結(jié)合提供負(fù)性信號(hào)，抑制淋巴細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[16‐17]。

PD‐1（CD279）作為CD28家族成員，屬于I型跨膜蛋白，其細(xì)胞質(zhì)區(qū)含有該家族特有的酪氨酸殘基，N端序列含有VDYGEL，存在于免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine‐based inhibito‐ry motif，ITIM）中，可以募集SH‐2區(qū)域；C端含有TEYATI序列，該序列可以形成免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序（immunoreceptor tyrosine‐based switch motif，ITSM）[18‐19]。作為PD‐1配體的PD‐L1（CD274）屬于B7家族成員，亦為I型跨膜蛋白，該蛋白由290個(gè)氨基酸組成，含有跨膜疏水區(qū)、IgC樣區(qū)、IgV樣區(qū)以及由30個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)，PD‐L1可以在活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面以及心臟、胸腺等組織中表達(dá)[20‐22]。PD‐1與PD‐L1結(jié)合后，能夠磷酸化ITSM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸，聚集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP‐2，進(jìn)而導(dǎo)致下游磷脂酰肌醇 3‐羥激酶（phosphatidylinositol 3‐hydroxy kinase，PI3K）與Sky發(fā)生去磷酸化，經(jīng)此信號(hào)通路傳遞抑制性信號(hào)[23]。抑制信號(hào)傳遞后免疫細(xì)胞的增殖、分化受到抑制，免疫反應(yīng)強(qiáng)度降低。PD‐1與PD‐L1結(jié)合后可以產(chǎn)生多種生理功能，如抑制炎性因子擴(kuò)散與釋放、維持T淋巴細(xì)胞的穩(wěn)定性，抑制淋巴細(xì)胞的增殖與分化，參與器官移植排斥與自身免疫疾病等，這些生理功能具有免疫負(fù)調(diào)控作用[24]。機(jī)體正常狀態(tài)下，PD‐1和PD‐L1的結(jié)合能夠維持自身的免疫耐性，防止自身免疫疾病的發(fā)生。然而機(jī)體中存在腫瘤細(xì)胞時(shí)，PD‐1與PD‐L1的結(jié)合能夠抑制淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中PD-1mRNA和PD-L1mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示PD‐1和PD‐L1在NSCLC組織中高表達(dá)，PD‐1和PD‐L1可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明，PD‐1和PD‐L1的表達(dá)情況與NSCLC患者的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況可能有關(guān)，預(yù)測(cè)PD‐1/PD‐L1信號(hào)通路可能通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與分化，使T淋巴細(xì)胞走向衰竭，導(dǎo)使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在其他組織器官中生長(zhǎng)。PD‐1和PD‐L1表達(dá)升高后可減少第二信號(hào)分子的來(lái)源，使T淋巴細(xì)胞的活化受到抑制，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后失去原有功能或者凋亡，腫瘤細(xì)胞可以成功避開(kāi)機(jī)體的免疫監(jiān)控，在其他部位不斷增殖。腫瘤中PD‐1、PD‐L1高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)PD‐1和PD‐L1抗體的敏感性增加，因此其表達(dá)狀態(tài)的檢測(cè)具有重要意義[25]。本研究的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，NSCLC組織中CD4+‐PD‐1、CD8+‐PD‐1、CD14+‐PD‐L1、CD68+‐PD‐L1的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織。這可能是因?yàn)镻D‐1/PD‐L1信號(hào)通路對(duì)T淋巴細(xì)胞的功能起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖、分化，抑制白細(xì)胞介素‐2（interleukin‐2，IL‐2）和γ干擾素（interferon‐γ，IFN‐γ）的分泌，抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的溶解活性，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞凋亡，使T淋巴細(xì)胞變成死亡或無(wú)能狀態(tài)；同時(shí)其還可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，維持該細(xì)胞特有的生物學(xué)功能，進(jìn)而抑制 T 淋巴細(xì)胞的活性[26‐27]。

綜述所述，PD‐1和PD‐L1在NSCLC組織中高表達(dá)，PD‐1/PD‐L1信號(hào)通路可能在NSCLC免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，該通路的高表達(dá)抑制了T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，研究PD‐1/PD‐L1信號(hào)通路在NSCLC免疫逃逸中的作用可以為臨床治療NSCLC提供新的方法。