朱瓊瓊，陳雅寧，盧文杰，董賢明

河南省第二人民醫(yī)院1消化內(nèi)科，2呼吸內(nèi)科，鄭州451191

肝癌是臨床中常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第5位，死亡率居世界第3位。近年來(lái)，肝癌的發(fā)病率和病死率逐年上升，但目前仍缺乏有效的防治方法[1]。微小RNA（microRNA，miR‐NA）通過(guò)與靶基因的3'UTR結(jié)合調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程。miRNA‐574‐5p已被證實(shí)在宮頸癌和乳頭狀甲狀腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其在腫瘤組織中的表達(dá)水平較高，下調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[1‐3]。哺乳動(dòng)物高溫需求因子A1（high temperature require‐ment factor A1，HTRA1）作為一種分泌蛋白，與細(xì)胞外基質(zhì)的降解密切相關(guān)[4]。研究報(bào)道，HTRA1參與食管癌、肝癌等疾病的發(fā)展過(guò)程，食管癌組織中HTRA1的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，肝癌組織中HTRA1mRNA的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織[5‐6]。但miRNA‐574‐5p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，且其是否通過(guò)靶向調(diào)控HTRA1的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲目前尚未可知。因此，本研究通過(guò)生物學(xué)技術(shù)，探究miRNA‐574‐5p和HTRA1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及miRNA‐574‐5p是否通過(guò)靶向調(diào)控HTRA1的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC‐7721、BEL‐7402和正常肝細(xì)胞株L02均由上海細(xì)胞庫(kù)提供，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二喹啉甲酸（bicin‐choninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，CCK‐8購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，慢病毒載體pGCL購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，HTRA1、細(xì)胞周期蛋白 D1（cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9、MMP14、p21、p27、甘油醛‐3‐磷酸脫氫酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)L02、HepG2、SMMC‐7721、BEL‐7402細(xì)胞均采用含10%胎牛血清和雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml）的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與細(xì)胞分組構(gòu)建anti‐miRNA‐574‐5p 及陰性對(duì)照質(zhì)粒 anti‐miRNA‐NC、miRNA‐574‐5p mimic、miRNA‐NC，同時(shí)構(gòu)建 si‐HTRA1及其陰性對(duì)照質(zhì)粒si‐NC、pcDNA‐HTRA1及其對(duì)照質(zhì)粒pcDNA。于6孔板中接種3×105/孔，CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育過(guò)夜；細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%時(shí)，加入無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，Lipofectami‐neTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后4～6 h更換新鮮培養(yǎng)基，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。獲得穩(wěn)定低表達(dá)miRNA‐574‐5p的 anti‐miRNA‐574‐5p細(xì)胞株，標(biāo)記為anti‐miRNA‐574‐5p組，其陰性對(duì)照anti‐miRNA‐NC細(xì)胞株標(biāo)記為anti‐miRNA‐NC組，過(guò)表達(dá)miR‐NA‐574‐5p 的 miRNA‐574‐5p 細(xì)胞株標(biāo)記為 miR‐NA‐574‐5p組，對(duì)照miRNA‐NC細(xì)胞株標(biāo)記為miR‐NA‐NC組，以及HTRA1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株標(biāo)記為pcDNA‐HTRA1組及其對(duì)照細(xì)胞株標(biāo)記為pcDNA組。同時(shí)，在穩(wěn)定低表達(dá)的 anti‐miRNA‐574‐5p 細(xì)胞株的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染HTRA1低表達(dá)si‐HTRA1獲得穩(wěn)定細(xì)胞株 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1（anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1 組）和 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC（anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC 組）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction ，PCR）檢測(cè)miRNA-574- 5 p、HTRA 1表達(dá)情況收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，采用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cD‐NA，采用ABI7500型PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系：95℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，共 40個(gè)循環(huán)。miRNA‐574‐5p的上游引物為 3'‐TACGATGAGTGTGTGTGTGTGAGTGT‐5'，下游引物為 5'‐GTCCTTGGTGCCCGAGTG‐3'；U6 的上游引物為 5'‐TACGAGTGCTCACTTCG‐GCAGC‐3'，下游引物為5'‐AACGCTTCAC‐GAATTTGCGT‐3'。HTRA1的 上游引 物 為 3'‐TG‐GAAACTCGGGAGGCCCGTT‐5'，下游引物為 5'‐TGGCTTTGCTGGACGTGAGTGAC‐3'；GAPDH的上游引物為 5'‐AGAAGGCTGGGGCTCATTTG‐3'，下游引物為5'‐AGGGGCCATCCACAGTCTTC‐3'。分別以U6、GAPDH為miRNA‐574‐5p、HTRA1 的內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 miRNA‐574‐5p、HTRA1的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá)情況采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度并稀釋蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉‐聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sul‐phate‐polyacryl amide gel electrophoresis，SDS‐PAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinyli‐dene fluoride，PVDF）膜；室溫脫脂奶粉封閉1 h；添加稀釋適當(dāng)比例的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次；二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次；滴加電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯影液，使用Image Quant LAS4010凝膠成像儀觀察目的蛋白條帶，采集圖片。分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，采用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中HTRA1、cyclin D1、p21、p27、MMP2、MMP9、MMP14蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 噻唑藍(lán)法檢測(cè)HepG 2細(xì)胞增殖情況調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度至5×103/ml接種于96孔板中，每孔100 μl，分別于 24、48、72 h 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered sa‐line，PBS）清洗細(xì)胞，每孔加入噻唑藍(lán)（methylthia‐zolyl tetrazolium，MTT）試劑20 μl，室溫孵育42 h，離心留下層細(xì)胞，每孔加入100 μl DMSO振蕩孵育15 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HepG 2細(xì)胞遷移和侵襲能力遷移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以每孔104個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室，下室加入含5% FBS的DMEM，5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)；12 h后取出小室，棄去培養(yǎng)基，棉簽擦去未穿過(guò)細(xì)胞，90%乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色5 min，PBS清洗；隨機(jī)選擇5個(gè)低倍鏡視野進(jìn)行觀察，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)目。侵襲實(shí)驗(yàn)：提前將Matrigel膠置于冰上解凍，并按照1∶2的體積比與無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基混勻制備Matrigel基質(zhì)膠；Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室，以每孔104個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA-574- 5 p對(duì)HTRA 1的影響構(gòu)建野生型pGL3‐HTRA1‐3'UTR（WT‐HTRA1 3'UTR）和突變型pGL3‐HTRA1‐3'UTR（MUT‐pGL3‐HTRA1‐3'UTR）表達(dá)載體，將構(gòu)建后的載體采用LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至anti‐miRNA‐NC、anti‐miRNA‐574‐5p HepG2 細(xì)胞，分別標(biāo)記為 miRNA‐NC+WT‐HTRA1 組、miRNA‐574‐5p+WT‐HTRA1 組 、miRNA‐NC+MUT‐HTRA1組 和 miRNA‐574‐5p+MUT‐HTRA1 組 。 轉(zhuǎn) 染 后48 h，采用熒光素酶活性檢測(cè)儀測(cè)定熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算熒光素酶的相對(duì)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-574- 5 p、HTRA 1 mRNA和HTRA 1蛋白在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)情況

L02、HepG2、SMMC‐7721和BEL‐7402細(xì)胞中miRNA‐574‐5p、HTRA1mRNA和HTRA1蛋白的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與L02細(xì)胞系比較，肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC‐7721、BEL‐7402 中 miRNA‐574‐5p 的表達(dá)水平均升高，HTRA1mRNA和HTRA1蛋白的表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同細(xì)胞中miRNA‐574‐ 5 p、HTRA 1 mRNA和HTRA 1蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

表1 不同細(xì)胞中miRNA‐574‐ 5 p、HTRA 1 mRNA和HTRA 1蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

注：*與L02比較，P＜0.05

細(xì)胞L 0 2 H e p G 2 S M M C‐7 7 2 1 B E L‐7 4 0 2 F值P值1.0 0±0.0 9 4.0 2±0.3 8*3.2 2±0.3 1*3.6 5±0.3 5*2 3 7.4 9 0＜0.0 1 1.0 1±0.0 8 0.3 3±0.0 3*0.4 9±0.0 5*0.4 2±0.0 4*3 9 2.8 0 7＜0.0 1 0.8 4±0.0 8 0.5 1±0.0 5*0.4 3±0.0 4*0.5 9±0.0 6*1 0 7.2 0 6＜0.0 1 m i R N A‐5 7 4‐5 p H T R A 1 m R N A H T R A 1蛋白

2.2 抑制miRNA-574- 5 p表達(dá)對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖能力及相關(guān)蛋白的影響

anti‐miRNA‐574‐5p 組 HepG2 細(xì)胞中 miRNA‐574‐5p的表達(dá)水平為（0.32±0.03），明顯低于anti‐miRNA‐NC組的（1.01±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.816，P＜0.01）。與anti‐miRNA‐NC 組比較，anti‐miRNA‐574‐5p組培養(yǎng)48、72 h 的 HepG2 細(xì)胞的增殖率均明顯降低，cyclin D1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，p21、p27蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

2.3 抑制miRNA-574- 5 p表達(dá)對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞遷移、侵襲及MMP相關(guān)蛋白的影響

與anti‐miRNA‐NC組比較，anti‐miRNA‐574‐5p組HepG2細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)目及MMP2、MMP9、MMP14蛋白的表達(dá)水平均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

2.4 HTRA 1過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

pcDNA‐HTRA1組HepG2細(xì)胞中HTRA1蛋白的表達(dá)水平為（0.81±0.08），明顯高于pcDNA組的（0.48±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.568，P＜0.01）。與pcDNA組比較，pcDNA‐HTRA1組HepG2細(xì)胞48、72 h的增殖率明顯降低，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，p21蛋白的表達(dá)水平明顯升高，遷移、侵襲數(shù)目明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表4）

2.5 miRNA-574- 5 p靶向調(diào)控HTRA 1的表達(dá)

Target Scan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR‐NA‐574‐5p與HTRA1的3'UTR區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)，提示HTRA1的3'UTR中含有與miRNA‐574‐5p互補(bǔ)的核苷酸序列（圖 1），根據(jù) miRNA‐574‐5p與HTRA1的潛在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建 WT‐HTRA1‐3'UTR和MUT‐HTRA1‐3'UTR質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miRNA‐574‐5p+WT‐HTRA1組 HepG‐2細(xì)胞的熒光素酶活性為（0.42±0.04），明顯低于miRNA‐NC+WT‐HTRA1組的（1.01±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.674，P＜0.01）。miRNA‐574‐5p+MUT‐HTRA1組HepG‐2細(xì)胞的熒光素酶活性為（1.02±0.09），與 miRNA‐NC+MUT‐HTRA1組的（1.04±0.08）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。West‐ern blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA‐574‐5p組HepG‐2細(xì)胞中HTRA1蛋白的表達(dá)水平為（0.21±0.02），低于miRNA‐NC組的（ 0.53±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；anti‐miRNA‐574‐5p 組 HepG‐2 細(xì)胞中HTRA1蛋白的表達(dá)水平為（0.89±0.08），高于anti‐miRNA‐NC組的（0.50±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；4組HepG‐2細(xì)胞中HTRA1蛋白的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=315.763，P＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)了 miRNA‐574‐5p可直接下調(diào)HTRA1的表達(dá)。

2.6 抑制HTRA 1表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miRNA-574- 5 p表達(dá)對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用

anti‐miRNA‐NC 組、anti‐miRNA‐574‐5p 組、an‐ti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC 組和 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1組HepG2細(xì)胞中HTRA1蛋白的的表達(dá)水平分別為（0.52±0.05）、（0.84±0.08）、（0.87±0.08）、（0.66±0.06），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.127，P＜0.01）。不同組別HepG2細(xì)胞的增殖（48、72 h）、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與anti‐miR‐NA‐NC組比較，anti‐miRNA‐574‐5p組HTRA1蛋白的表達(dá)水平升高，培養(yǎng)48、72 h的肝癌HepG2細(xì)胞的增殖率均降低，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)水平均下降，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目均減少，p21蛋白的表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC 組比較，anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1組HTRA1蛋白的表達(dá)水平降低，培養(yǎng)48、72 h肝癌HepG2細(xì)胞的增殖率均升高，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)水平均升高，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)目均增多，p21蛋白的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表5）

表2 不同組別肝癌HepG 2細(xì)胞的增殖率及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

表2 不同組別肝癌HepG 2細(xì)胞的增殖率及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

組別a n t i‐m i R N A‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p組t值P值5 4.2 8±5.0 3 4 8.6 5±4.2 8 1.2 9 9＞0.0 5 6 5.3 5±6.2 8 3 4.5 6±3.2 5 6.5 4 9＜0.0 1 7 7.2 5±7.0 6 2 9.6 5±2.8 6 1 1.3 2 3＜0.0 1 0.6 3±0.0 6 0.2 6±0.0 3 1 3.5 1 1＜0.0 1 0.3 1±0.0 3 0.7 2±0.0 7 1 3.1 8 7＜0.0 1 0.2 8±0.0 3 0.6 7±0.0 6 1 4.2 4 1＜0.0 1增殖率（%）2 4 h 4 8 h 7 2 h c y c l i n D 1蛋白p 2 1蛋白p 2 7蛋白

表3 不同組別肝癌HepG 2細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目及MMP相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

表3 不同組別肝癌HepG 2細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目及MMP相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

組別a n t i‐m i R N A‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p組t值P值6 8.4 2±6.3 5 3 1.4 8±3.2 7 1 2.6 6 8＜0.0 1 5 9.6 1±5.3 7 2 7.2 4±3.6 8 1 2.1 8 0＜0.0 1 0.5 9±0.0 5 0.1 8±0.0 3 1 7.2 2 3＜0.0 1 0.6 7±0.0 6 0.2 8±0.0 3 1 4.2 4 1＜0.0 1 0.6 3±0.0 6 0.2 1±0.0 2 1 6.2 6 7＜0.0 1遷移細(xì)胞數(shù)目 侵襲細(xì)胞數(shù)目M M P 2蛋白M M P 9蛋白M M P 1 4蛋白

表4 不同組別肝癌HepG 2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲情況及cyclin D 1、 p21、MMP 2、MMP 9蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

表4 不同組別肝癌HepG 2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲情況及cyclin D 1、 p21、MMP 2、MMP 9蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

組別pcDNA組pcDNA‐HTRA1組t值P值增殖率（%）24 h 56.34±5.02 50.63±5.02 0.490＞0.05 48 h 67.25±6.24 39.41±3.22 4.271＜0.01 72 h 76.24±7.03 32.46±2.07 9.453＜0.01遷移細(xì)胞數(shù)目72.46±7.38 39.52±3.55 9.853＜0.01侵襲細(xì)胞數(shù)目62.41±6.28 35.44±4.18 8.757＜0.01 cyclin D1蛋白0.65±0.06 0.32±0.03 12.050＜0.01 p21蛋白0.28±0.03 0.68±0.07 12.865＜0.01 MMP2蛋白0.61±0.06 0.22±0.03 14.241＜0.01 MMP9蛋白0.69±0.07 0.36±0.03 10.614＜0.01

圖1 HTRA 1的 3'UTR和miRNA‐574‐ 5 p序列

3 討論

肝癌的高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率嚴(yán)重影響患者的生存情況，目前多采用手術(shù)、放療、化療的方法進(jìn)行治療[7]。但是目前的治療技術(shù)仍無(wú)法有效防治肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，因此，本研究以研究肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲的分子機(jī)制為突破口，尋找靶向治療分子，探究靶向治療對(duì)肝癌防治的意義。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，隨著對(duì)miRNA研究的深入，研究證實(shí)，miRNA的失調(diào)在包括惡性腫瘤、炎癥性疾病等在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用[8]。目前，以miRNA模擬物及siRNA為靶向分子治療的方案?jìng)涫茚t(yī)學(xué)界青睞。miRNA‐574‐5p已被證實(shí)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，乳腺癌患者血清中的miRNA‐574‐5p水平明顯高于良性乳腺病變患者及健康人群，且miRNA‐574‐5p水平與乳腺癌患者的臨床特征及預(yù)后密切相關(guān)[2,9]；miRNA‐574‐5p在宮頸癌組織中高表達(dá)，抑制miRNA‐574‐5p的表達(dá)可使宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均明顯下降[10]。研究顯示，敲除miRNA‐574‐5p表達(dá)能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4,11]。本研究結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞中miRNA‐574‐5p的表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞；進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA‐574‐5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA‐574‐5p的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖率明顯下降，遷移和侵襲數(shù)目均明顯降低，p21、p27蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP14蛋白的表達(dá)水平亦均明顯降低，與上述研究結(jié)果一致，提示抑制miRNA‐574‐5p的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

HTRA1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的同源性的不同結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶家族成員[12]，被證實(shí)作為腫瘤抑制因子表達(dá)于多種腫瘤中，但其在腫瘤組織中隨著惡性程度的升高呈下調(diào)性表達(dá)[13‐15]。HTRA1在浸潤(rùn)性宮頸癌組織中的表達(dá)水平低于原位癌，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的作用減弱[16]。HTRA1在胰腺癌組織中的表達(dá)水平明顯降低，通過(guò)調(diào)控Notch‐1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，抑制胰腺癌細(xì)胞遷移[17]。HTRA1表達(dá)的下調(diào)與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[18]。HTRA1在腦膜瘤、肝癌組織中的表達(dá)水平均明顯低于正常組織，抑制其表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力[19‐20]。本研究結(jié)果顯示，HTRA1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于正常肝細(xì)胞；進(jìn)一步驗(yàn)證HTRA1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)HTRA1的HepG2細(xì)胞的增殖率、遷移和侵襲數(shù)目及cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，p21蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與上述研究結(jié)果一致，提示過(guò)表達(dá)HTRA1可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

Target Scan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miRNA‐574‐5p與HTRA1的3'UTR區(qū)域存在潛在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，僅 miRNA‐574‐5p+WT‐HTRA1組HepG2細(xì)胞中miRNA‐574‐5p的表達(dá)水平明顯降低，提示miRNA‐574‐5p可通過(guò)直接與HTRA1的3'UTR區(qū)域結(jié)合抑制HTRA1的表達(dá)；進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA‐574‐5p與HTRA1在肝癌發(fā)展中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA‐574‐5p的HepG‐2細(xì)胞中HTRA1蛋白的表達(dá)水平明顯下降，抑制miRNA‐574‐5p表達(dá)的HepG‐2細(xì)胞中HTRA1蛋白的表達(dá)水平明顯升高，提示miRNA‐574‐5p可靶向負(fù)調(diào)控HTRA1的表達(dá)；進(jìn)一步研究miRNA‐574‐5p靶向HTRA1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，結(jié)果顯示，與 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC組比較，an‐ti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1組肝癌細(xì)胞的增殖率、遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目，以及cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，p21蛋白的表達(dá)水平明顯降低，提示抑制HTRA1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miRNA‐574‐5p表達(dá)引起的HepG2細(xì)胞增殖抑制及遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)減少的作用，提示miRNA‐574‐5p可靶向HTRA1調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

表5 抑制HTRA 1表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miRNA‐574‐ 5 p表達(dá)對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用（± s）

表5 抑制HTRA 1表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miRNA‐574‐ 5 p表達(dá)對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用（± s）

注：a與anti‐miRNA‐NC組比較，P＜0.05；b與anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC組比較，P＜0.05

組別a n t i‐m i R N A‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p+s i‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p+s i‐H T R A 1組F值P值5 5.3 2±5.3 5 5 1.2 3±5.0 2 4 8.2 6±4.2 8 5 2.6 1±5.2 8 1.8 6 1＞0.0 5 6 8.2 5±6.0 7 3 8.6 5±3.2 8 a 3 7.9 1±3.0 7 5 9.6 2±5.0 7 b 8 0.2 7 4＜0.0 1 7 6.9 8±7.0 2 3 1.5 2±3.2 8 a 2 9.6 5±2.7 7 6 5.4 2±6.0 7 b 1 6 4.6 4 0＜0.0 1 7 3.5 2±7.3 2 3 2.4 9±3.7 1 a 2 8.5 4±3.5 1 5 9.6 7±5.3 4 b 2 0 7.8 6 8＜0.0 1 6 2.3 8±6.1 6 2 4.3 1±3.0 5 a 2 1.9 7±3.4 8 4 8.6 8±4.3 9 b 2 3 3.1 3 0＜0.0 1 0.6 4±0.0 6 0.2 5±0.0 3 a 0.2 2±0.0 3 0.5 1±0.0 5 b 2 5 2.1 5 2＜0.0 1 0.3 0±0.0 3 0.7 3±0.0 7 a 0.7 6±0.0 7 0.4 9±0.0 5 b 1 7 0.9 0 9＜0.0 1 0.6 1±0.0 6 0.2 1±0.0 3 a 0.1 9±0.0 2 0.4 7±0.0 4 b 3 0 9.1 6 9＜0.0 1 0.6 8±0.0 7 0.2 9±0.0 3 a 0.2 7±0.0 2 0.5 5±0.0 5 b 2 2 2.2 9 9＜0.0 1增殖率（%）2 4 h 4 8 h 7 2 h遷移細(xì)胞數(shù)目侵襲細(xì)胞數(shù)目c y c l i n D 1蛋白p 2 1蛋白M M P 2蛋白M M P 9蛋白

綜上所述，本研究初步探討了miRNA‐574‐5p在肝癌中的作用及機(jī)制，驗(yàn)證了miRNA‐574‐5p靶向調(diào)控HTRA1的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，為肝癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。本研究尚存在不足之處，關(guān)于miRNA‐574‐5p和HTRA1靶向調(diào)控通路有待進(jìn)一步深入研究。