秦艷紅，王永江，王爽，喬奇，田雨婷，張德勝，張振臣

甘薯羽狀斑駁病毒O株系和RC株系中國(guó)分離物全基因組序列分析及其遺傳特征

秦艷紅，王永江，王爽，喬奇，田雨婷，張德勝，張振臣

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

【】對(duì)甘薯羽狀斑駁病毒（，SPFMV）O株系中國(guó)分離物（SPFMV-O-Ch1）和RC株系中國(guó)分離物（SPFMV-RC-Ch1）的基因組全序列進(jìn)行克隆，明確SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因組結(jié)構(gòu)特征及其遺傳變異情況，為研究甘薯羽狀斑駁病毒的致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。根據(jù)GenBank中登錄的SPFMV基因組全序列設(shè)計(jì)2對(duì)簡(jiǎn)并引物和3對(duì)特異性引物，利用RT-PCR方法，從感染SPFMV的甘薯葉片中擴(kuò)增SPFMV O株系和RC株系中國(guó)分離物的基因組全長(zhǎng)序列，將目的片段分別克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)序列測(cè)定、分析和拼接，獲得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列，利用DNAMAN和MEGA7對(duì)SPFMV基因組全序列及不同編碼區(qū)序列進(jìn)行遺傳變異和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，利用RDP軟件分析SPFMV基因組重組情況。經(jīng)序列測(cè)定和拼接，結(jié)果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因組分別包含10 922和10 851 nt，均包含一個(gè)開放閱讀框，分別由10 557和10 482 nt組成，編碼一個(gè)多聚蛋白，分別由3 518和3 493個(gè)氨基酸殘基組成。兩個(gè)分離物均在P1蛋白內(nèi)編碼一個(gè)P1N-PISPO蛋白，在P3蛋白內(nèi)編碼一個(gè)P3N-PIPO蛋白?；蚪M全序列核苷酸一致性分析表明，SPFMV-O-Ch1與SPFMV-RC-Ch1的一致性為87.3%，與GenBank登錄的其他分離物基因組全序列一致性為86.0%—95.8%，與Ruk73分離物的一致性最高，為95.8%，與11-1分離物的一致性最低，為86.0%。SPFMV-RC-Ch1與GenBank登錄的其他分離物基因組全序列一致性為85.9%—98.7%，與IS90分離物的一致性最高，為98.7%，與Aus1-2B分離物的一致性最低，為85.9%?；诙嗑鄣鞍谆蚝塑账嵝蛄械倪z傳進(jìn)化樹分析表明，SPFMV-O-Ch1與Ordinary、10-O和17-O等O株系的分離物形成一個(gè)分支，SPFMV-RC-Ch1與S、IS90和CW137等RC株系的分離物形成一個(gè)分支。重組分析結(jié)果表明，O-Ch1分離物中發(fā)現(xiàn)3個(gè)重組事件，分別發(fā)生在7 731—9 710、135—10 012和4 825—6 948 nt，RC-Ch1沒(méi)有發(fā)現(xiàn)重組事件。我國(guó)的SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1分離物的基因組結(jié)構(gòu)與其他分離物相同，O-Ch1與O株系分離物一致性較高，RC-Ch1與RC株系分離物一致性較高，O-Ch1分離物檢測(cè)到3個(gè)重組事件，RC-Ch1未發(fā)現(xiàn)重組事件。

甘薯羽狀斑駁病毒；株系；全基因組序列；遺傳變異；重組分析

0 引言

【研究意義】甘薯羽狀斑駁病毒（，SPFMV）屬于馬鈴薯Y病毒科（）馬鈴薯Y病毒屬（）病毒，是侵染甘薯的重要病毒之一，在全世界甘薯產(chǎn)區(qū)和主要甘薯品種上均有發(fā)生[1]。SPFMV的寄主范圍較窄，僅侵染旋花科植物[2-3]，其傳播介體為蚜蟲，靠蚜蟲以非持久方式進(jìn)行傳播[4]。SPFMV單獨(dú)侵染甘薯時(shí)一般產(chǎn)生輕微花葉癥狀或無(wú)癥狀表現(xiàn)，對(duì)甘薯產(chǎn)量影響較小[5]，但其在田間常與甘薯褪綠矮化病毒（，SPCSV）混合侵染甘薯，產(chǎn)生甘薯復(fù)合病毒病（sweet potato virus disease，SPVD），表現(xiàn)為植株嚴(yán)重矮化，葉片畸形、花葉、褪綠、明脈等癥狀，SPFMV的含量比單獨(dú)侵染時(shí)增加600倍，對(duì)甘薯造成嚴(yán)重危害[5-6]。根據(jù)核苷酸序列及在寄主上的癥狀類型，SPFMV可劃分為SPFMV普通株系（Ordinary，SPFMV-O）、褐裂株系（Russet Crack，SPFMV-RC）和東非株系（East Africa，SPFMV-EA）3個(gè)株系[1,6-7]。獲得SPFMV中國(guó)主要株系類型的基因組全序列，對(duì)該病毒的遺傳進(jìn)化及分子變異研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1990年，李汝剛等[8]利用血清學(xué)方法首次從我國(guó)北京、江蘇、四川和山東等地區(qū)的甘薯樣品上檢測(cè)到SPFMV。目前，SPFMV在我國(guó)發(fā)生比較普遍，在南方、北方和長(zhǎng)江中下游三大甘薯產(chǎn)區(qū)的多個(gè)省（直轄市）均有分布[9-10]。Qin等[10-11]對(duì)SPFMV的CP基因進(jìn)行了分子變異分析，明確了我國(guó)SPFMV的株系類型，目前我國(guó)甘薯上存在O、RC和EA株系，O株系是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)株系，分布最為廣泛，其次是RC株系。1997年，Sakai等[12]利用RT-PCR方法從日本甘薯上克隆了SPFMV RC株系S分離物的基因組全序列，對(duì)該分離物的基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白進(jìn)行了分析，SPFMV與馬鈴薯Y病毒屬其他成員的結(jié)構(gòu)相似，包含一個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），經(jīng)切割加工產(chǎn)生P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP 10個(gè)成熟蛋白，是基因組最大的馬鈴薯Y病毒屬成員。2009年，Kreuze等[13]利用深度測(cè)序結(jié)合RT-PCR方法從秘魯獲得了EA株系Piu3分離物的基因組全序列。2010年，Yamasaki等[14]從日本獲得了O株系的兩個(gè)分離物Ordinary和10-O的基因組全序列，并對(duì)Ordinary和10-O分離物及RC株系的代表性分離物S和EA株系的代表性分離物EA-Piu3等的基因組結(jié)構(gòu)、序列相似性等進(jìn)行了比較分析。隨后，韓國(guó)、西班牙、澳大利亞、東帝汶、美國(guó)、日本、巴西、南非、阿根廷、秘魯、肯尼亞和烏干達(dá)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的不同分離物基因組全序列陸續(xù)被報(bào)道[15-18]。與其他馬鈴薯Y病毒屬病毒一樣，SPFMV在P3內(nèi)部通過(guò)移碼策略編碼一個(gè)P3N-PIPO蛋白。近年來(lái)的研究表明，SPFMV等4種侵染甘薯的馬鈴薯Y病毒屬病毒在P1蛋白內(nèi)通過(guò)移碼還編碼一個(gè)具有基因沉默抑制子功能的P1N-PISPO蛋白[16,19-20]。【本研究切入點(diǎn)】目前，SPFMV在中國(guó)僅有部分序列報(bào)道，尚未見關(guān)于SPFMV-O株系和SPFMV-RC株系中國(guó)分離物基因組全序列的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從我國(guó)甘薯樣品中克隆獲得SPFMV-O和SPFMV-RC株系中國(guó)分離物全基因組序列，將兩個(gè)株系的中國(guó)分離物與GenBank中登錄的其他國(guó)家分離物進(jìn)行比較分析，了解SPFMV-O和SPFMV-RC株系中國(guó)分離物的基因組結(jié)構(gòu)及遺傳進(jìn)化特征。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2016年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 植物材料 2015年4月，在河南省南陽(yáng)市唐河縣采集植株矮化、葉脈發(fā)黃、葉片皺縮等癥狀的甘薯病毒病樣品1份，將甘薯植株種植于25—28℃防蟲溫室中，16 h光照、8 h黑暗培養(yǎng)。同時(shí)采集甘薯莖蔓上部幼嫩葉片保存于-70℃冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Reverse Transcriptase XL反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Premix LADNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體和DL5000分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒和柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒均購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞為筆者實(shí)驗(yàn)室制備并保存于-70℃冰箱；其他生化常用試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的SPFMV-O株系和SPFMV-RC株系不同分離物的基因組全序列（表1）設(shè)計(jì)了2對(duì)簡(jiǎn)并引物和3對(duì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 稱取約0.1 g甘薯病樣葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，按照Trizol總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取甘薯病樣葉片總RNA，保存于-70℃冰箱中備用。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增基因組序列 第一鏈cDNA合成參照Reverse Transcriptase XL反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以O(shè)ligodT為引物，以總RNA為模板合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10 μL）：5×AMV Buffer 2 μL、OligodT引物1 μL、dNTP mixture（10 mmol·L-1）1 μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、RNA模板5 μL；42℃保溫60 min，16℃保溫5 min。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：cDNA 5 μL、2×Premix LADNA聚合酶25 μL、上游和下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL、加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，根據(jù)目的條帶大小不同，72℃延伸2—6 min，循環(huán)30次后，72℃延伸10 min。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將電泳鑒定正確的目的條帶利用OMEGA公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行切膠純化。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序 參照TaKaRa公司pMD19-T載體說(shuō)明書，將純化的目的片段分別連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌液PCR鑒定篩選到陽(yáng)性克隆，每個(gè)樣品選取3—5個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行5′和3′端RACE試驗(yàn)。利用BLAST比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.2.4 全基因組序列拼接及分析 利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序成功的基因片段進(jìn)行序列拼接，利用軟件MEGA 7.0將SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1分離物與GenBank上登錄的其他分離物（表1）進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹中各分支置信度（Bootstrap）進(jìn)行1 000次重復(fù)分析。基因重組分析采用Recombination Detection Program（RDP v5.3）軟件，利用RDP5軟件中的RDP、GENECONV、Chimaera、MaxChi、Bootscan、Siscan和3Seq 7種方法對(duì)序列進(jìn)行重組分析，以≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)3種以上方法同時(shí)檢測(cè)到重組時(shí)，認(rèn)為其為有意義的重組事件[21-23]。

表1 本研究所用分離物的名稱、株系、來(lái)源和登錄號(hào)信息

表2 引物序列及目的片段大小

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)的1-F/4711-R、4689-F/10380-R、SPFMV- O-4160-F/SPFMV-O-5284-R、SPFMV-RC-4260-F/ SPFMV- RC-8220-R、SPFMV-RC-7580-F/SPFMV-11000-R等引物擴(kuò)增SPFMV-O株系中國(guó)分離物和SPFMV-RC株系中國(guó)分離物的不同基因組片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明獲得了預(yù)期大小的目的條帶，條帶大小分別約為4 790 bp（O-1）、1 270 bp（O-2）、5 700 bp（O-3）、4 710 bp（RC-1）、3 820 bp（RC-2）、3 420 bp（RC-3）（圖1）。

2.2 SPFMV-O和SPFMV-RC株系中國(guó)分離物基因組全序列克隆及結(jié)構(gòu)分析

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，通過(guò)RACE試驗(yàn)獲得了兩個(gè)分離物的5′和3′末端序列，確保引物及重疊區(qū)域堿基無(wú)變異，拼接后獲得了SPFMV-O和SPFMV-RC株系中國(guó)分離物的全基因組序列，分別命名為SPFMV-O-Ch1（GenBank登錄號(hào)為KY296450）和SPFMV-RC-Ch1（GenBank登錄號(hào)為KY296451）。SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC- Ch1與已報(bào)道的其他分離物基因組結(jié)構(gòu)特征相一致，3′末端均包含一個(gè)poly (A)尾序，編碼一個(gè)大的多聚蛋白，加工產(chǎn)生10個(gè)成熟蛋白，從N端到C端依次為P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP。除多聚蛋白外，還通過(guò)移碼策略分別編碼一個(gè)P1N-PISPO和P3N-PIPO蛋白。SPFMV-O-Ch1基因組全長(zhǎng)為10 922 nt，5′和3′非翻譯區(qū)（UTR）分別含有114和251 nt，多聚蛋白基因位于基因組的115—10 671處，由10 557 nt組成，多聚蛋白大小為3 518 aa。SPFMV-RC-Ch1基因組全長(zhǎng)為10 851 nt，5′和3′非翻譯區(qū)（UTR）分別含有121和248 nt，多聚蛋白基因位于基因組的122—10 603處，由10 482 nt組成，多聚蛋白含3 493 aa。SPFMV-O-Ch1編碼的P1蛋白含有689 aa，SPFMV-RC-Ch1編碼的P1蛋白含有664 aa，兩者大小不同。兩個(gè)分離物編碼的其他蛋白大小相同，依次為HC-Pro（458 aa）、P3（352 aa）、6K1（52 aa）、CI（643 aa）、6K2（53 aa）、VPg（192 aa）、NIa-Pro（243 aa）、NIb（521 aa）和CP（315 aa）。

M：DL5000分子量標(biāo)準(zhǔn) DL5000 marker；1：O-1擴(kuò)增片段Amplification of O-1；2：O-2擴(kuò)增片段Amplification of O-2；3：O-3擴(kuò)增片段Amplification of O-3；4：RC-1擴(kuò)增片段Amplification of RC-1；5：RC-2擴(kuò)增片段Amplification of RC-2；6：RC-3擴(kuò)增片段Amplification of RC-3

2.3 基因組序列一致性分析

利用DNAMAN軟件對(duì)SPFMV-O-Ch1、SPFMV-RC-Ch1分離物以及GenBank中登錄的其他48個(gè)分離物基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析（表3），結(jié)果表明SPFMV-O-Ch1與SPFMV-RC-Ch1之間的全序列核苷酸一致性較低，為87.3%，多聚蛋白的核苷酸和氨基酸一致性分別為88.2%和94.0%，屬于不同的株系。SPFMV-O-Ch1與GenBank中登錄的48個(gè)分離物基因組全序列核苷酸一致性為86.0%—95.8%，與烏干達(dá)的Ruk73分離物一致性最高（95.8%），與美國(guó)的11-1分離物一致性最低（86.0%）。多聚蛋白的比對(duì)結(jié)果表明，SPFMV-O-Ch1與48個(gè)分離物核苷酸一致性范圍為87.0%—95.8%，與Ruk73分離物一致性最高，為95.8%，與11-1和澳大利亞Aus3-2BC分離物一致性最低，為87.0%；氨基酸一致性范圍為92.1%—97.6%，與阿根廷O-Arg分離物一致性最高，為97.6%，與肯尼亞SRF109a分離物一致性最低，為92.1%。

SPFMV-RC-Ch1與其他48個(gè)分離物全基因組核苷酸一致性為85.9%—98.7%，與韓國(guó)的IS90分離物一致性最高（98.7%），與澳大利亞的Aus1-2B分離物一致性最低（85.9%）。多聚蛋白的比對(duì)結(jié)果表明，SPFMV-RC-Ch1與韓國(guó)IS90分離物的核苷酸和氨基酸一致性最高，分別為98.8%和99.3%，與澳大利亞Aus1-2B分離物的核苷酸和氨基酸一致性最低，分別為87.0%和92.8%。

在SPFMV編碼的10個(gè)蛋白中，P1蛋白變異最大，O-Ch1、RC-Ch1分離物與48個(gè)分離物氨基酸序列一致性分別為81.2%—96.4%和80.6%—99.2%，而且不同株系P1蛋白的大小不同，屬于O株系的O-Ch1分離物P1蛋白包含689 aa，屬于RC株系的RC-Ch1分離物P1蛋白包含664 aa，而屬于EA株系的Piu3分離物P1蛋白包含724 aa。最保守的是CI蛋白，O-Ch1、RC-Ch1分離物與48個(gè)分離物氨基酸序列一致性分別為97.0%—99.7%和97.5%—99.8%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

基于SPFMV多聚蛋白基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，O-Ch1分離物與來(lái)自烏干達(dá)的O株系Ruk73分離物形成一個(gè)小分支，親緣關(guān)系最近，與其他屬于O株系的分離物在一個(gè)大分支上，而與來(lái)自秘魯?shù)腅A株系Piu3分離物親緣關(guān)系也較近。RC-Ch1分離物與來(lái)自韓國(guó)RC株系的IS90分離物聚類到同一個(gè)小分支上，親緣關(guān)系最近，與屬于RC株系其他31個(gè)分離物形成一個(gè)大分支。對(duì)變異最大的P1蛋白基因核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明O-Ch1分離物與阿根廷的O-Arg、日本的Ordinary及17-O等屬于O株系的分離物形成一個(gè)小分支，親緣關(guān)系較近。RC-Ch1分離物與RC株系的IS90分離物（韓國(guó)）聚類在同一個(gè)小分支上，親緣關(guān)系最近（圖2）。

表3 O-Ch1、RC-Ch1與其他分離物核苷酸和氨基酸序列一致性

-：沒(méi)有相應(yīng)的氨基酸No corresponding amino acid

圖2 SPFMV分離物多聚蛋白和P1蛋白核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析

比較保守的CI蛋白核苷酸序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，O-Ch1分離物與來(lái)自東帝汶的O株系TM66B分離物親緣關(guān)系最近，RC-Ch1分離物與IS90分離物親緣關(guān)系最近。對(duì)CP蛋白核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果與P1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹相似，O-Ch1與O-Arg、10-O、Ordinary及17-O等屬于O株系的分離物形成一個(gè)小分支，親緣關(guān)系較近，RC-Ch1與IS90分離物在同一個(gè)小分支上，親緣關(guān)系最近（圖3）。

圖3 SPFMV分離物CI蛋白和CP蛋白核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析

綜上所述，基于O-Ch1分離物基因組不同編碼區(qū)域構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，親緣關(guān)系最近的分離物不盡相同；而RC-Ch1分離物基因組不同編碼區(qū)域構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果相一致，均與來(lái)自韓國(guó)RC株系的IS90分離物親緣關(guān)系最近。推測(cè)O-Ch1分離物可能發(fā)生了重組。

2.5 基因組全序列重組分析

為了明確我國(guó)的O-Ch1、RC-Ch1分離物是否存在潛在的重組事件，利用RDP5軟件中的7種算法（≤0.05為顯著），將O-Ch1、RC-Ch1與GenBank登錄的其他48個(gè)分離物基因組全序列進(jìn)行重組分析。結(jié)果表明（表4），在O-Ch1分離物中檢測(cè)到3個(gè)潛在的重組事件（其他分離物重組事件未列出）。重組事件1發(fā)生在7 731—9 710 nt，獲得7種算法支持，最低值為1.095×10-44（3Seq），最高值為8.317× 10-17（GENECONV），主要親本為日本的O株系Ordinary分離物，次要親本為東帝汶的O株系TM33C分離物。重組事件2發(fā)生在135—10 012 nt，獲得4種算法支持，最低值為1.561×10-56（3Seq），最高值為7.437× 10-3（Chimaera），主要親本為秘魯?shù)腅A株系Piu3分離物，次要親本為澳大利亞的O株系A(chǔ)us5-3B分離物。重組事件3發(fā)生在4 825—6 948 nt，獲得3種算法支持，最低值為1.104×10-3（MaxChi），最高值為1.256×10-2（3Seq），主要親本為澳大利亞的O株系A(chǔ)us13B分離物，次要親本為秘魯?shù)腅A株系Piu3分離物。RC-Ch1分離物未檢測(cè)到重組事件發(fā)生。

表4 O-Ch1分離物的重組分析

3 討論

SPFMV是甘薯上分布最廣泛的病毒之一，其可以與SPCSV發(fā)生協(xié)生作用，形成毀滅性病害SPVD。自我國(guó)首次檢測(cè)到SPFMV的發(fā)生以來(lái)，SPFMV在我國(guó)逐漸擴(kuò)散蔓延，成為甘薯上最重要的病毒之一。國(guó)內(nèi)對(duì)SPFMV開展了多項(xiàng)研究，主要集中在病毒的分離純化[2,24-25]、生物學(xué)性狀[26]、抗體制備[27]、檢測(cè)技術(shù)[28-38]、分布及遺傳多樣性[9-11,39-40]等方面，而對(duì)SPFMV中國(guó)分離物的基因組序列測(cè)定還未開展相關(guān)研究。筆者研究室前期對(duì)SPFMV的發(fā)生、分布及分子變異等進(jìn)行了研究，明確了我國(guó)SPFMV的主要株系類型為O和RC，在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)對(duì)我國(guó)SPFMV O株系和RC株系的基因組開展了相關(guān)研究，利用RT-PCR方法結(jié)合RACE技術(shù)獲得了這兩個(gè)主要株系的基因組全序列，獲得的O-Ch1和RC-Ch1分離物是中國(guó)SPFMV完整基因組的首次報(bào)道。

對(duì)O-Ch1和RC-Ch1兩個(gè)分離物的基因組結(jié)構(gòu)及編碼的主要蛋白分析發(fā)現(xiàn)，O株系和RC株系編碼的P1蛋白大小不同，不同株系（分離物）之間P1蛋白的氨基酸一致性最低，變異最大；而其余蛋白大小均相同，氨基酸一致性高于P1蛋白。Yamasaki等[14]對(duì)SPVC和SPFMV的O、RC和EA 3個(gè)株系代表分離物的基因組進(jìn)行了比較分析，表明不同株系之間P1蛋白的核苷酸和氨基酸一致性低于其余9個(gè)蛋白；Kwak等[15]對(duì)韓國(guó)SPFMV等5種侵染甘薯的馬鈴薯Y病毒屬病毒基因組分析結(jié)果表明，無(wú)論是種間還是株系間，P1蛋白的變異均最大。本研究結(jié)果與前人的報(bào)道[14-15]相一致。

早期的研究表明，依據(jù)CP基因序列分析，SPFMV可分為C、O、RC和EA 4個(gè)株系，C株系與其他3個(gè)株系遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，已將其作為新種重新命名為甘薯病毒C（，SPVC），EA株系僅在東非的一些地區(qū)存在，而O和RC株系不存在地理局限性[41]。近年來(lái)，隨著種質(zhì)資源的擴(kuò)散和種薯的調(diào)運(yùn)，EA株系現(xiàn)在已不僅局限于東非地區(qū)，我國(guó)已報(bào)道了EA株系的存在[10]。本研究獲得的O-Ch1和RC-Ch1兩個(gè)分離物分別與O株系和RC株系的分離物聚類成一個(gè)分支，O-Ch1變異較大，推測(cè)可能是由于O株系為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)株系，地理分布上最廣泛，更易隨著頻繁種質(zhì)資源交換和調(diào)運(yùn)，而發(fā)生變異重組等。

SPFMV經(jīng)常發(fā)生種內(nèi)重組，不同株系之間重組很常見，比如對(duì)10-O分離物的分析結(jié)果表明，該分離物是由O、RC和EA 3個(gè)株系重組形成的，P1蛋白是重組的熱點(diǎn)區(qū)域[20]。韓國(guó)的GJ122分離物與10-O分離物類似，也發(fā)生了株系間重組，在P1蛋白區(qū)域內(nèi)存在重組位點(diǎn)，是由O株系和RC株系重組產(chǎn)生的[15]。本研究獲得的O-Ch1分離物可能是由O株系和EA株系重組產(chǎn)生的，重組位點(diǎn)發(fā)生在NIa-NIb基因、P1基因、CI基因和CP基因處。由于田間常常發(fā)生SPFMV不同株系混合侵染現(xiàn)象，不同株系基因組之間容易發(fā)生重組變異，從而增強(qiáng)病毒群體的適應(yīng)能力，種內(nèi)重組可能是造成SPFMV株系分化較復(fù)雜的主要原因，不同株系之間的重組還可能形成新的株系，甚至產(chǎn)生更多的新種等，分析病毒的重組并明確重組熱點(diǎn)區(qū)域?qū)α私獠《镜倪M(jìn)化至關(guān)重要。

4 結(jié)論

完成了甘薯羽狀斑駁病毒O株系和RC株系中國(guó)分離物基因組全序列測(cè)定?；蚪M結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，我國(guó)兩個(gè)分離物與其他國(guó)家分離物的基因組結(jié)構(gòu)相一致。兩個(gè)分離物之間序列相似性較低，變異較大，分別屬于兩個(gè)不同的株系。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，SPFMV-O-Ch1與O株系的分離物形成一個(gè)分支，SPFMV-RC-Ch1與RC株系的分離物形成一個(gè)分支，基因組重組分析結(jié)果顯示，O-Ch1分離物檢測(cè)到3個(gè)重組事件，RC-Ch1未檢測(cè)到重組事件。

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Complete nucleotide sequence analysis and genetic characterization of theO and RC strains isolated from China

QIN YanHong, WANG YongJiang, WANG Shuang, QIAO Qi, TIAN YuTing, ZHANG DeSheng, ZHANG ZhenChen

(Institute of Plant Protection, Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Key Laboratory of Crop Pest Control/ IPM Key Laboratory in Southern part of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhengzhou 450002)

【】The objective of this study is to clone the complete nucleotide sequence of Chinese isolate of(SPFMV) O and RC strains, elucidate the genomic structural characterization and variation of SPFMV-O-Ch1 and SPFMV-RC-Ch1, and to lay a foundation for the study of pathogenic mechanism of SPFMV.【】According to the SPFMV genome sequences available in GenBank database, 2 pairs of degenerate primers and 3 pairs of specific primers were designed, the whole genome of SPFMV O and RC strains isolated from China was amplified by RT-PCR from sweet potato leaves infection with SPFMV and subsequently cloned into vector pMD19-T and sequenced. The complete genome sequences of SPFMV-O-Ch1 and SPFMV-RC-Ch1 isolates were assembled by using DNAMAN. Genetic variation analyses of complete genomic sequences, polyproteins, and individual protein sequences were performed using DNAMAN. Neighbor-joining phylogenetic tree of SPFMV-O-Ch1 and SPFMV-RC-Ch1 isolates with other isolates was constructed using MEGA7.0 software. Recombination analyses were carried out using RDP software.【】The amplification and sequencing revealed that the complete nucleotide sequence of SPFMV-O-Ch1 and SPFMV-RC-Ch1 isolates was 10 992 nucleotides (nt) and 10 851 nt in length, respectively. The viral genome of SPFMV-O-Ch1 isolate contained a single open reading frame (ORF) of 10 557 nt encoding a polyprotein of 3 518 aa. SPFMV-RC-Ch1 isolate polyprotein consisted of 10 482 nt and encoded 3 493 aa. Two small ORFs, P1N-PISPO and P3N-PIPO were identified in the P1 and P3 proteins of these two isolates. Pairwise comparisons of the complete genome nucleotide sequence showed that O-Ch1 had 87.3% identity with RC-Ch1 isolate and shared 86.0%-95.8% sequence identity with other SPFMV isolates. It was most closely related to the isolate Ruk73 with 95.8% nt identity and lowest nt identity with 11-1 isolate (86.0%). RC-Ch1 and other SPFMV isolates shared 85.9%-98.7% sequence identity at the complete genome nucleotide sequence level. It had the highest nt identity with IS90 isolate (98.7%), and had lowest nt identity with Aus1-2B isolate (85.9%). Phylogenetic tree analysis based on polyprotein gene indicated that SPFMV-O-Ch1 formed a branch with the isolates of O strain containing Ordinary, 10-O and 17-O, and SPFMV-RC-Ch1 formed a branch with the isolates of RC strain containing S, IS90 and CW137.Recombination analysis showed that there were three potential significant recombination events occurred in 7 731- 9 710, 135-10 012 and 4 825-6 948 nt of O-Ch1 isolate genome, respectively. No recombination event was detected in the complete genome of RC-Ch1 isolate. 【】The genomic organizations of SPFMV-O-Ch1 and SPFMV-RC-Ch1 isolates were same to other isolates. O-Ch1 isolate was closely related to the isolates of O strain and RC-Ch1 isolate was closely related to those isolates of RC strain. Three recombination events were detected in O-Ch1 isolate, but no recombination event was detected in RC-Ch1 isolate.

(SPFMV); strain; complete nucleotide sequence; genetic variation; recombination analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.11.007

2019-11-07；

2019-11-28

國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-10-B13）、河南省自然科學(xué)基金（162300410160）、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金（2019ZC37）

秦艷紅，E-mail：qinyanhong6040@163.com。通信作者張振臣，E-mail：zhangzhenchen@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）