朱子健，陳思雨，粟俊，陶永勝,3

刺葡萄酒酒精發(fā)酵過程中氨基酸組成與果香酯類物質(zhì)生成的關(guān)聯(lián)分析

朱子健1，陳思雨1，粟俊2，陶永勝1,3

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2湖南刺葡萄研究中心，湖南洪江 418200；3陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心， 陜西楊凌 712100）

【】研究刺葡萄發(fā)酵過程中氨基酸的化學(xué)組成與果香酯類物質(zhì)生成的關(guān)聯(lián)，為刺葡萄酒增香釀造提供理論指導(dǎo)。試驗(yàn)以刺葡萄品種‘湘珍珠’為研究對(duì)象，以‘赤霞珠’葡萄為對(duì)照，添加釀酒酵母啟動(dòng)酒精發(fā)酵，每隔24 h取樣，分別采用HPLC和GC-MS方法測(cè)定氨基酸和酯類物質(zhì)的組成及含量，并通過Pearson相關(guān)性分析建立二者之間的數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)。刺葡萄中除脯氨酸之外的氨基酸總體含量為‘赤霞珠’葡萄的3倍，天冬氨酸、纈氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸含量分別達(dá)到‘赤霞珠’葡萄中對(duì)應(yīng)氨基酸含量的2.4倍、2.2倍、4.2倍、7.7倍和3倍，但丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量?jī)H為‘赤霞珠’葡萄中對(duì)應(yīng)氨基酸含量的10%、35%和20%。刺葡萄發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯、中鏈脂肪酸乙酯含量?jī)H為‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵所得上述酯類物質(zhì)的55%、11%和69%。Pearson相關(guān)性分析顯示，刺葡萄發(fā)酵過程中丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與乙酸酯、脂肪酸乙酯的相關(guān)性系數(shù)在0.552—0.837，較‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵體系中相應(yīng)的相關(guān)性系數(shù)顯著偏低，這可能與刺葡萄酒果香酯類物質(zhì)含量偏低有關(guān)。刺葡萄中含量偏低的丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸可能限制了刺葡萄酒發(fā)酵體系中果香酯類物質(zhì)的積累。

葡萄酒；刺葡萄；氨基酸；果香酯類；相關(guān)性分析

0 引言

【研究意義】刺葡萄是中國特色野生葡萄，釀造而成的刺葡萄酒呈現(xiàn)深紫色或紅寶石色，花青素和總酚含量高，具有很好的抗氧化特性[1]。研究表明，刺葡萄酒香氣較弱，品種香氣成分及其前體物質(zhì)含量偏低，發(fā)酵形成的果香特征是刺葡萄酒的主要香氣特征[2]。因此，刺葡萄酒的增香釀造應(yīng)以改善發(fā)酵香氣為主。酯類物質(zhì)是紅葡萄酒中重要的發(fā)酵香氣成分[3]，以乙酸酯和短-中鏈脂肪酸乙酯為主的果香酯類物質(zhì)與葡萄酒的果香特征密切相關(guān)，通常作為葡萄酒增香釀造的目標(biāo)產(chǎn)物[4]。葡萄酒發(fā)酵過程中果香酯類的形成與氨基酸密切相關(guān)，支鏈氨基酸在酵母的作用下通過Ehrlich途徑脫羧、還原，生成相應(yīng)的高級(jí)醇，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成酯和酸[5]，從而影響葡萄酒發(fā)酵酯類物質(zhì)的含量。通過調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)中氨基酸的組成，將有望針對(duì)性提高刺葡萄酒果香酯類物質(zhì)的含量，提高發(fā)酵香氣質(zhì)量。但目前為止，針對(duì)刺葡萄酒發(fā)酵環(huán)境中氨基酸及果香酯類物質(zhì)的研究較少。分析刺葡萄酒精發(fā)酵過程中的氨基酸組成與果香酯類物質(zhì)生成的關(guān)聯(lián)性，將有利于促進(jìn)基于氨基酸組成調(diào)控的刺葡萄酒增香釀造研究的發(fā)展，并促進(jìn)其他果酒增香釀造技術(shù)的開拓創(chuàng)新?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】此前，有關(guān)刺葡萄酒的研究主要集中在保健價(jià)值和功能性成分上，如花色苷和白藜蘆醇[6-7]，對(duì)刺葡萄酒香氣匱乏的技術(shù)問題仍缺少針對(duì)性研究。刺葡萄酒增香釀造的研究起步較晚，本研究團(tuán)隊(duì)嘗試通過混菌發(fā)酵優(yōu)化刺葡萄酒的發(fā)酵香氣，并在一定程度上提高了刺葡萄酒中果香酯類物質(zhì)的含量[8]，然而上述研究仍無法確定刺葡萄酒發(fā)酵香氣淡弱、果香酯類含量低的內(nèi)在原因。影響葡萄酒發(fā)酵香氣成分的因素較多。其中，發(fā)酵葡萄汁中-氨基酸的組成對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中高級(jí)醇和酯類物質(zhì)的生成具有重要影響[9]，異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸是高級(jí)醇及其相關(guān)酯類物質(zhì)的重要前體[10]。Hernández-ORTE等[11]根據(jù)11種葡萄品種的氨基酸譜配制模擬葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)大量揮發(fā)性香氣化合物與葡萄汁氨基酸組成相關(guān)。PROCOPIO等[12]配置了34種不同氨基酸譜的模擬酒精發(fā)酵環(huán)境，通過PLS分析建立了理想發(fā)酵環(huán)境下氨基酸輪廓對(duì)主要香氣成分影響的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸是影響香氣活性成分含量的最重要解釋變量。也有研究者通過相關(guān)性分析與線性擬合發(fā)現(xiàn)在模擬葡萄汁酒精發(fā)酵條件下氨基酸含量與揮發(fā)性香氣成分含量之間存在線性關(guān)系[13]。然而，上述研究主要在模擬葡萄汁發(fā)酵環(huán)境中進(jìn)行，對(duì)真實(shí)葡萄酒發(fā)酵環(huán)境中氨基酸組成及含量與果香酯類物質(zhì)的關(guān)聯(lián)性研究很少。大多數(shù)研究專注于在發(fā)酵前補(bǔ)充氨基酸，忽視了對(duì)葡萄醪及葡萄發(fā)酵過程中氨基酸組成的研究。測(cè)定葡萄醪初始狀態(tài)及發(fā)酵過程中的氨基酸組成，明確氨基酸與果香酯類物質(zhì)的關(guān)聯(lián)，將有利于規(guī)避不必要的氨基酸補(bǔ)充，避免可同化氮含量過高導(dǎo)致的負(fù)面影響。【本研究切入點(diǎn)】國內(nèi)對(duì)刺葡萄酒增香釀造的研究尚處于起步階段，有必要從更多角度開發(fā)刺葡萄酒香氣優(yōu)化方案?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以刺葡萄品種‘湘珍珠’為試驗(yàn)對(duì)象，研究刺葡萄醪、刺葡萄酒發(fā)酵過程中氨基酸及果香酯類物質(zhì)的組成和含量，并以‘赤霞珠’葡萄為發(fā)酵對(duì)照組，分析發(fā)酵過程中氨基酸組成與果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性，對(duì)比刺葡萄發(fā)酵體系與赤霞珠發(fā)酵體系之間上述相關(guān)性的差異，初步確定限制刺葡萄酒果香質(zhì)量的氨基酸營養(yǎng)因素，為刺葡萄酒增香釀造提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院釀造與風(fēng)味實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 葡萄原料與試驗(yàn)菌種

赤霞珠：于2018年8月采自陜西合陽葡萄基地，含糖量207.5 g?L-1，含酸量5 g?L-1（以酒石酸計(jì)）。

刺葡萄（湘珍珠）：于2018年8月采自湖南懷化，含糖量172.5 g?L-1，初始汁含酸量2.3 g?L-1（以酒石酸計(jì)）。

試驗(yàn)菌株：釀酒酵母（）ACTIFLORE F33，簡(jiǎn)稱F33，購于法國Laffort公司。

1.2 儀器與試劑

HW.SY21-KP8電熱恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表公司）；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長沙高新技術(shù)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器公司）；ME203E電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；10RTEX-5旋渦震蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；FE28 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；DW-YL270低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限公司）；GCMS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津公司）；Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器（沃特世科技（上海）有限公司）。

分析純化學(xué)試劑：葡萄糖、亞硫酸溶液購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；五水合硫酸銅、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸（36%—38%）購于四川西隴科學(xué)有限公司；四水合酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、無水乙酸鈉、2, 4-二硝基氟苯（DNFB）。

色譜純化學(xué)試劑及標(biāo)準(zhǔn)品：超純水，色譜純乙腈。L-天冬氨酸、L-色氨酸、L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、-氨基丁酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸購于上海源葉生物科技有限公司；L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸購于北京索萊寶科技有限公司。乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、2-乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸甲酯、己酸異戊酯、辛酸異戊酯購于北京Sigma-Aldrich公司。

定容緩沖液：取KH2PO43.4 g于500 mL容量瓶中，加入0.1 mol?L-1NaOH溶液145.5 mL，加超純水定容。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒釀造 將‘赤霞珠’‘湘珍珠’葡萄進(jìn)行除梗破碎，分別裝入準(zhǔn)備好的20 L透明玻璃發(fā)酵罐中，每個(gè)品種的釀造處理重復(fù)2次，每罐取樣40 mL作為初始樣品。加入60 mg?L-1SO2并在4℃下浸漬24 h，隨后向發(fā)酵罐中加入釀酒酵母，轉(zhuǎn)移至20℃恒溫箱中啟動(dòng)酒精發(fā)酵，每隔24 h取樣，每次取樣40 mL。殘?zhí)切∮? g?L-1后結(jié)束發(fā)酵[14]，并取樣40 mL作為最終酒樣。樣品置于-20℃冰箱中保存。

1.3.2 氨基酸分析 氨基酸衍生方法：使用移液槍吸取經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 mL，加入1 mL離心管中，加0.05 mol?L-1NaHCO3溶液0.1 mL后搖勻，再加入5% DNFB-乙腈溶液40 μL并搖勻。將離心管置于60℃恒溫水浴鍋內(nèi)，水浴加熱60 min后取出，置于避光環(huán)境下冷卻至室溫。隨后加入定容緩沖液0.76 mL并搖勻，于黑暗處放置15 min后進(jìn)行色譜分離[15]。

氨基酸色譜分析：色譜柱為C18分離柱（Agilent SB-C18色譜柱；Analytical 4.6 mm×250 mm；5-Micron）；柱溫33℃，進(jìn)樣量20 μL，采用四元梯度分析；流動(dòng)相總流量為1 mL?min-1；二極管陣列掃描波長：320—400 nm。流動(dòng)相A為色譜純乙腈，流動(dòng)相B為超純水，流動(dòng)相C為pH 6.4的乙酸鈉溶液。色譜柱洗脫程序如下：初始8% A，8% B，84% C；0—2 min：8%—15% A，8%—15% B，84%—70% C；2—4 min：15%—17% A，15%—17% B，70%—66% C；4—8 min：17%—20% A，17%—20% B，66%—60% C；8—14 min：20%—21% A，20%—22% B，60%—57% C；14—24 min：21%—28% A，22%—27% B，57%—45% C；24—27 min：28%—28% A，27%—27% B，45%—45% C；27—36 min：28%—49% A，27%—49% B，45%—2% C；36—40 min：49%—8% A，49%—8% B，2%—84% C。

定性定量方法：通過氨基酸單標(biāo)溶液與混標(biāo)溶液的色譜分析結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行定性。將混標(biāo)溶液梯度稀釋后，通過外標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用5點(diǎn)法繪制。

1.3.3 香氣物質(zhì)分析 SPME樣品處理：本試驗(yàn)香氣物質(zhì)的提取采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）的方法，使用DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30 μm涂層厚度，2 cm可伸縮長度）及SPME 57330-U聯(lián)用手柄（Supelco, Bellefonte PA, USA）。20 mL頂空瓶中加入8 mL酒樣，2.0 g氯化鈉，2-辛醇（內(nèi)標(biāo)，400 μg?L-1）和攪拌子在40℃水浴中平衡15 min后，再用萃取纖維在40℃下攪拌吸附30 min后取出，立即手動(dòng)進(jìn)樣至氣相色譜進(jìn)樣口（230℃）解析5 min。每個(gè)酒樣的萃取操作重復(fù)2次。

GC-MS分析：使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津GCMS-QP2020），柱型號(hào)為DB-WAX（60 m×0.25 mm，涂層厚度0.25 μm，Agilent JandW，USA）。不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣（99.999%），載氣流速為1.5 mL?min-1。程序升溫：以3℃?min-1從40℃至130℃，再以4℃?min-1從130℃至250℃，保持8 min。進(jìn)樣口溫度230℃，連接桿溫度220℃，離子源溫度200℃，電子電源電壓70 eV，質(zhì)譜為電離轟擊（EI）模式，全掃描質(zhì)譜范圍25—350 amu，掃描頻率0.2 s/次。

定性定量分析：配制酯類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的模擬酒溶液，進(jìn)行上述HS/SPME-GC-MS分析，采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比、保留指數(shù)對(duì)比和NIST 17質(zhì)譜譜庫查詢進(jìn)行目標(biāo)酯類物質(zhì)的定性。采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)目標(biāo)酯類物質(zhì)進(jìn)行定量，2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，具體定量方法參考Hu等[16]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Pearson相關(guān)性分析（Pearson Correlation Analysis）對(duì)發(fā)酵過程中氨基酸與果香酯類物質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理主要使用SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）軟件。使用OriginPro 9.0繪制發(fā)酵過程中氨基酸含量變化趨勢(shì)圖。

2 結(jié)果

2.1 葡萄酒精發(fā)酵過程中氨基酸的變化

本研究通過HPLC-PAD對(duì)刺葡萄和赤霞珠葡萄醪樣品和發(fā)酵汁樣品中的13種氨基酸成分進(jìn)行定性定量分析（表1）。刺葡萄醪總氨基酸含量顯著低于‘赤霞珠’葡萄，僅為‘赤霞珠’葡萄醪中總氨基酸含量的33%，但刺葡萄醪除脯氨酸外的氨基酸總量則顯著高于‘赤霞珠’，約為‘赤霞珠’葡萄醪的3倍。除脯氨酸外，刺葡萄中的丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量顯著低于‘赤霞珠’，僅為‘赤霞珠’葡萄醪中上述氨基酸含量的10%、35%和20%。刺葡萄中天冬氨酸、纈氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸的含量則顯著高于‘赤霞珠’，分別達(dá)到‘赤霞珠’葡萄醪中上述氨基酸含量的2.4倍、2.2倍、4.2倍、7.7倍、3倍。‘赤霞珠’葡萄與刺葡萄的氨基酸組成及含量具有明顯差異。亮氨酸、色氨酸和蛋氨酸在兩種葡萄醪樣品中均未檢出。

發(fā)酵過程中氨基酸含量變化如圖1所示。刺葡萄發(fā)酵體系中的天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸含量在發(fā)酵第1天有所升高。隨著酒精發(fā)酵的進(jìn)一步進(jìn)行，除酪氨酸外，發(fā)酵酒樣的氨基酸含量逐漸減少。酪氨酸的變化具有品種差異性，其含量在‘赤霞珠’發(fā)酵過程中略有下降，而在刺葡萄發(fā)酵中則有所增加。刺葡萄最終酒樣中的酪氨酸含量高于‘赤霞珠’酒樣。脯氨酸是兩種葡萄發(fā)酵過程中含量最高的氨基酸。亮氨酸、色氨酸及蛋氨酸在兩種葡萄發(fā)酵全程均未檢出。

表1 葡萄醪中的氨基酸含量

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，不同小寫字母表示通過單因素方差分析所得樣本間顯著性差異結(jié)果（＜0.05）；“ND”表示未檢出。下同

Data are mean values of two independent experiments ± standard deviation. Mean values displaying different letters within each row are significantly different according to the One-way ANOVA at 95% confidence level. “ND” means “Not detected”. The same as below

2.2 葡萄酒精發(fā)酵過程中果香酯類物質(zhì)的變化

經(jīng)HS/SPME-GC-MS對(duì)發(fā)酵葡萄酒樣品中香氣成分的定性定量分析，本研究在刺葡萄酒和赤霞珠葡萄酒發(fā)酵體系中共檢出17種酯類物質(zhì)，包括7種乙酸酯、2種短鏈脂肪酸乙酯（SCFAEE，C2—C5）、5種中鏈脂肪酸乙酯（MCFAEE，C6—C13）和3種其他酯類物質(zhì)，其中6種酯類物質(zhì)的OAV＞1（OAV：氣味活性值，OAV=香氣化合物濃度/該香氣化合物氣味閾值），包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯。刺葡萄和‘赤霞珠’發(fā)酵體系中果香酯類含量變化分別見表2、表3。在刺葡萄發(fā)酵體系中，乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯和中鏈脂肪酸乙酯含量始終低于‘赤霞珠’，在最終酒樣內(nèi)的含量分別為16 233、132.4和711.9 μg?L-1，僅為‘赤霞珠’最終酒樣中乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯和中鏈脂肪酸乙酯含量的55%、11%和69%。其他酯類含量在刺葡萄發(fā)酵過程中呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，在發(fā)酵第5天、第7天和第10天時(shí)含量高于‘赤霞珠’，而在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，刺葡萄酒中其他酯類含量略低于‘赤霞珠’葡萄酒。從總體上看，刺葡萄酒中的果香酯類（乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯和中鏈脂肪酸乙酯）含量顯著低于‘赤霞珠’葡萄酒，尤其是對(duì)葡萄酒果香特征具有突出貢獻(xiàn)的中鏈脂肪酸乙酯含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于‘赤霞珠’葡萄酒。

圖1 酒精發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化

2.3 葡萄發(fā)酵過程中氨基酸與果香酯類的相關(guān)性分析

由于酪氨酸在發(fā)酵過程中的變化具有品種特異性，且在刺葡萄發(fā)酵中具有增加趨勢(shì)，因此無法判斷其消耗情況，不將其列入相關(guān)性分析對(duì)象。為確定發(fā)酵過程中的氨基酸含量變化是否與果香酯類物質(zhì)含量變化具有明顯關(guān)聯(lián)性，以及兩種葡萄發(fā)酵過程中上述關(guān)聯(lián)性是否存在差異，本試驗(yàn)對(duì)葡萄發(fā)酵過程中氨基酸含量與果香酯類含量進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，如表4所示。發(fā)酵過程中大多數(shù)氨基酸與果香酯類變化趨勢(shì)相反，因此結(jié)果以負(fù)相關(guān)為主?？偘被岷浚ǔ彼幔┡c果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性分析表明，葡萄酒發(fā)酵過程中總氨基酸與乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯和中鏈脂肪酸乙酯的相關(guān)性系數(shù)較高，但與其他酯類物質(zhì)的相關(guān)性系數(shù)較低。對(duì)比刺葡萄與‘赤霞珠’對(duì)照組中總氨基酸含量與果香酯類含量的Pearson相關(guān)性系數(shù)可見，‘赤霞珠’中的總氨基酸含量（除脯氨酸）與乙酸酯、短鏈和中鏈脂肪酸乙酯含量具有極強(qiáng)相關(guān)性，分別達(dá)到0.919、0.875和0.825；刺葡萄發(fā)酵組的總氨基酸與乙酸酯（0.873）、短鏈脂肪酸乙酯（0.864）、中鏈脂肪酸乙酯（0.750）的相關(guān)性系數(shù)低于‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵組的上述相關(guān)性系數(shù)。

通過8種氨基酸含量與果香酯類物質(zhì)含量的相關(guān)性分析可見，在‘赤霞珠’發(fā)酵體系中，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、纈氨酸與乙酸酯、短鏈和中鏈脂肪酸乙酯具有強(qiáng)相關(guān)性或極強(qiáng)相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)范圍為0.689—0.910；丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與上述果香酯類的相關(guān)性系范圍為0.705—0.978，與果香酯類物質(zhì)具有強(qiáng)相關(guān)性或極強(qiáng)相關(guān)性，其中苯丙氨酸與乙酸酯相關(guān)性系數(shù)最高，丙氨酸與短鏈脂肪酸乙酯相關(guān)性系數(shù)最高。在刺葡萄發(fā)酵體系的相關(guān)性分析中，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、-氨基丁酸、纈氨酸與乙酸酯、短鏈和中鏈脂肪酸乙酯具有強(qiáng)相關(guān)性或極強(qiáng)相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)在0.669—0.976；丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與上述果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性系數(shù)在0.552—0.837。

表2 刺葡萄酒精發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)的含量

表中數(shù)據(jù)為兩組獨(dú)立平行試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差?！癗F”表示未找到。下同 Data are mean values of two independent experiments ± standard deviation. “NF” means “Not Found”. The same as below

表3 赤霞珠酒精發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)的含量

將刺葡萄發(fā)酵過程中氨基酸與果香酯類物質(zhì)含量的相關(guān)性系數(shù)與‘赤霞珠’對(duì)比可見，在發(fā)酵過程中，刺葡萄的精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、-氨基丁酸、纈氨酸與果香酯類的相關(guān)性系數(shù)較‘赤霞珠’偏高。與上述情況相反，刺葡萄發(fā)酵過程中的苯丙氨酸與乙酸酯、各類脂肪酸乙酯的相關(guān)性系數(shù)低于‘赤霞珠’葡萄，異亮氨酸與乙酸酯、中鏈脂肪酸乙酯的相關(guān)性低于‘赤霞珠’葡萄，丙氨酸與乙酸酯和短鏈脂肪酸乙酯的相關(guān)性低于‘赤霞珠’葡萄，上述相關(guān)性系數(shù)較‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵過程中對(duì)應(yīng)的相關(guān)性系數(shù)偏低3%—54%。為直觀展現(xiàn)‘赤霞珠’與刺葡萄發(fā)酵過程中丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性差異，對(duì)上述氨基酸含量變化與各類果香酯類物質(zhì)的含量變化進(jìn)行線性擬和，擬合結(jié)果如圖2所示。通過線性擬和分析可以發(fā)現(xiàn)，‘赤霞珠’發(fā)酵體系中丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與果香酯類的線性擬合效果較刺葡萄發(fā)酵體系存在明顯差異，刺葡萄發(fā)酵體系中的上述氨基酸與果香酯類物質(zhì)的線性擬和效果較差。在果香酯類物質(zhì)含量分析中，‘赤霞珠’酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸酯和短-中鏈脂肪酸乙酯含量均高于刺葡萄酒，表明不同葡萄品種的發(fā)酵酒中果香酯類物質(zhì)含量的差異可能與氨基酸-果香酯類的相關(guān)性差異具有一定關(guān)聯(lián)。結(jié)合氨基酸含量研究可見，氨基酸的含量差異與相關(guān)性差異具有一定規(guī)律性：刺葡萄中精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、-氨基丁酸、纈氨酸含量高于‘赤霞珠’，丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量低于‘赤霞珠’。上述結(jié)果表明，刺葡萄中丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量偏低與刺葡萄酒果香酯類物質(zhì)含量偏低具有一定關(guān)聯(lián)，刺葡萄發(fā)酵過程中的氨基酸組成與果香酯類物質(zhì)的生成之間具有“木桶效應(yīng)”，刺葡萄中含量偏低的丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸可能限制了果香酯類物質(zhì)在發(fā)酵過程中的合成，進(jìn)而導(dǎo)致最終酒樣中果香酯類含量的差異。

此外，刺葡萄中除脯氨酸外的總氨基酸含量高于‘赤霞珠’葡萄，但其發(fā)酵酒中的果香酯類含量仍然低于‘赤霞珠’葡萄酒，這表明不能將果香酯類合成的有機(jī)氮營養(yǎng)因素單一地歸結(jié)于酵母可利用的總氨基酸含量或某種氨基酸含量的多少，發(fā)酵過程中發(fā)酵基質(zhì)的氨基酸組成對(duì)果香酯類含量具有更加重要的影響，良好的氨基酸組成可能更有利于果香酯類物質(zhì)的生成。

表4 酒精發(fā)酵過程中氨基酸與發(fā)酵酯類物質(zhì)的相關(guān)性系數(shù)

3 討論

3.1 刺葡萄酒精發(fā)酵過程中氨基酸、果香酯類物質(zhì)的含量變化規(guī)律

氨基酸存在于葡萄果實(shí)，經(jīng)過葡萄浸漬后進(jìn)入發(fā)酵體系中從而被酵母利用，參與葡萄酒中的發(fā)酵香氣的合成。葡萄果實(shí)中氨基酸組成與葡萄品種關(guān)系密切[23]，而其測(cè)定結(jié)果也根據(jù)測(cè)定方法不同而存在較大差異[24]，本研究未在葡萄醪及發(fā)酵汁樣品中檢出亮氨酸，這與此前部分研究結(jié)果不同，推測(cè)可能受到特定年份葡萄種植條件及環(huán)境的影響。GUTIéRREZ- GAMBOA等[25]對(duì)智利莫萊谷產(chǎn)區(qū)的‘佳麗釀’葡萄醪氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，其中色氨酸在多個(gè)樣品中含量偏低，且蛋氨酸含量最低僅為0.14 mg?L-1；高年發(fā)等[26]對(duì)寧夏4個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄醪樣品進(jìn)行氨基酸測(cè)定，7種被測(cè)樣品中僅有3種檢出色氨酸，且均未檢出蛋氨酸。上述研究表明葡萄醪中色氨酸、蛋氨酸含量極低，而本研究未在刺葡萄與‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵體系中檢出色氨酸與蛋氨酸。目前為止尚無對(duì)刺葡萄醪及刺葡萄發(fā)酵過程中氨基酸含量的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵第1天時(shí)天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸含量略有升高，這與高年發(fā)等[26]對(duì)浸漬前期氨基酸含量變化的研究結(jié)果相似，推測(cè)是在浸漬過程中，存在于果皮、果肉和果籽中的部分天冬氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸浸出至發(fā)酵葡萄汁所致，但尚需更多研究予以證明。在刺葡萄和‘赤霞珠’對(duì)照組的酒精發(fā)酵過程中，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸含量在發(fā)酵過程中呈下降趨勢(shì)，部分氨基酸最終被完全消耗。酪氨酸含量在刺葡萄發(fā)酵過程中逐漸下降，而在‘赤霞珠’中呈現(xiàn)波動(dòng)變化，具有明顯的品種差異性，這與高年發(fā)等[26]對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、多個(gè)葡萄品種的研究結(jié)果基本一致，但與GARDE- CERDáN等[27]的研究結(jié)果不同。刺葡萄中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、纈氨酸含量高于‘赤霞珠’，而苯丙氨酸、丙氨酸、異亮氨酸含量低于‘赤霞珠’。由于脯氨酸通常不被視為酵母可同化氮[28]，因此本文不再討論脯氨酸的含量變化及其與果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性情況。

葡萄酒中的酯類物質(zhì)對(duì)香氣的貢獻(xiàn)曾被長期低估，而如今有更多的研究證明其對(duì)香氣質(zhì)量的貢獻(xiàn)不可忽視[29]。目前為止，對(duì)刺葡萄醪及刺葡萄發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)的研究較少，鮑瑞峰[30]對(duì)刺葡萄果實(shí)及刺葡萄酒中部分果香酯類成分進(jìn)行了研究，但其未對(duì)香氣物質(zhì)含量進(jìn)行定量分析；本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中對(duì)刺葡萄酒中香氣物質(zhì)含量進(jìn)行了定量測(cè)定，但未對(duì)發(fā)酵過程中的香氣物質(zhì)含量變化進(jìn)行全程監(jiān)控，且未將刺葡萄酒的香氣物質(zhì)組成與其他葡萄酒進(jìn)行對(duì)比分析[8]。本研究對(duì)刺葡萄及‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵過程中果香酯類物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)刺葡萄酒發(fā)酵過程中果香酯類物質(zhì)含量始終低于‘赤霞珠’，其中乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯和中鏈脂肪酸乙酯含量顯著低于‘赤霞珠’，這可能是導(dǎo)致刺葡萄酒香氣貧乏的直接原因。

3.2 刺葡萄酒發(fā)酵體系中氨基酸與果香酯類物質(zhì)生成的關(guān)聯(lián)

氨基酸組成與葡萄品種相關(guān)，通過葡萄發(fā)酵，這些氨基酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生特異性的香氣物質(zhì)，形成酒的特異性香氣，從而形成不同風(fēng)格的葡萄酒[31]。氨基酸經(jīng)過微生物分解代謝產(chǎn)生的香氣物質(zhì)具有一定對(duì)應(yīng)性，支鏈氨基酸（Leu、Ile、Val）被轉(zhuǎn)化為具有麥芽味、果香和汗味的香氣化合物；芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Trp）的分解代謝產(chǎn)生具有花香、化學(xué)溶劑味和糞便氣味的化合物；天冬氨酸（Asp）被分解成具有黃油味的香氣物質(zhì)，含硫氨基酸（Met、Cys）被轉(zhuǎn)化為具有煮白菜、肉味和大蒜味的化合物[32]。在酒精發(fā)酵過程中，氨基酸主要通過Ehrlich途徑進(jìn)行代謝，通過轉(zhuǎn)氨、脫羧等過程生成對(duì)應(yīng)的高級(jí)醇及脂肪酸[33]，并進(jìn)一步反應(yīng)生成酯類物質(zhì)。然而，更多研究表明在實(shí)際發(fā)酵環(huán)境中，氨基酸對(duì)香氣物質(zhì)生成的影響并不是嚴(yán)格一一對(duì)應(yīng)的，酵母可能將氨基酸代謝過程中產(chǎn)生的α-酮酸重新分配至其他類似的生物化學(xué)反應(yīng)途徑[13]。因此，在具有多種可同化氮來源的復(fù)雜發(fā)酵基質(zhì)中，某種氨基酸代謝的中間產(chǎn)物可能同時(shí)參與多種香氣物質(zhì)的合成，從而對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的多種香氣物質(zhì)的含量產(chǎn)生影響。

對(duì)于氨基酸與香氣的研究不是一蹴而就的，研究者們將氨基酸歸于氮源，又將氮源分為無機(jī)氮和氨基酸進(jìn)行添加試驗(yàn)。HERNáNDEZ-ORTE等[34]根據(jù)11種葡萄品種的氨基酸譜配制模擬葡萄汁，進(jìn)行模擬發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)一些揮發(fā)性化合物（乙酸乙酯、高級(jí)醇、異丁酸、己酸、辛酸）存在顯著差異，進(jìn)行多元回歸分析后發(fā)現(xiàn)，這些揮發(fā)性化合物與葡萄汁氨基酸組成相關(guān)。GARDE-CERDáN等[35]在氮缺乏葡萄醪中進(jìn)行氨基酸補(bǔ)充試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，總酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯與添加的氨基酸量成正比；PROCOPIO等[12]通過對(duì)不同氨基酸譜的模擬汁發(fā)酵及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸含量會(huì)影響最終酒樣中酯類物質(zhì)的含量；CHEN等[36]發(fā)現(xiàn)荔枝酒中的苯丙氨酸含量影響到乙酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯和己酸苯乙酯的含量；HERNáNDEZ-ORTE等[37]發(fā)現(xiàn)外加苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸會(huì)促進(jìn)乙酸苯乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等乙酸酯和中鏈脂肪酸乙酯含量的增加。上述研究印證了本研究中天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與乙酸酯、中鏈脂肪酸乙酯具有較高相關(guān)性的結(jié)果。

本研究綜合分析了刺葡萄發(fā)酵組與‘赤霞珠’葡萄間的氨基酸及果香酯類物質(zhì)組成、氨基酸-果香酯類相關(guān)性數(shù)據(jù)，在前人對(duì)氨基酸與香氣物質(zhì)關(guān)聯(lián)性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確真實(shí)發(fā)酵環(huán)境下刺葡萄的氨基酸組成與果香酯類物質(zhì)的生成之間具有顯著相關(guān)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)葡萄中氨基酸組成對(duì)果香酯類物質(zhì)生成可能具有“木桶效應(yīng)”：刺葡萄中含量顯著低于‘赤霞珠’葡萄的丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸構(gòu)成了刺葡萄氨基酸組成的“短板”，限制了刺葡萄酒發(fā)酵體系中果香酯類物質(zhì)積累，導(dǎo)致刺葡萄酒中果香酯類物質(zhì)含量低于‘赤霞珠’。盡管刺葡萄中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、纈氨酸含量高于‘赤霞珠’葡萄，但上述含量較高的氨基酸無法彌補(bǔ)刺葡萄發(fā)酵環(huán)境中丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量偏低導(dǎo)致的果香酯類物質(zhì)含量低下，在刺葡萄酒發(fā)酵過程中成為果香酯類物質(zhì)合成的限制因素。這可能表明發(fā)酵葡萄汁中均衡且充足的氨基酸組成對(duì)果香酯類物質(zhì)的生成具有重要作用。在刺葡萄發(fā)酵過程中補(bǔ)充上述“短板”氨基酸將可能提高刺葡萄酒中果香酯類物質(zhì)的含量。盡管有研究顯示在發(fā)酵過程中對(duì)任意單一氨基酸的補(bǔ)充都將在一定程度上影響特定果香酯類的含量[13]，但對(duì)于優(yōu)化刺葡萄酒果香酯類含量、提高香氣質(zhì)量而言，基于特定產(chǎn)區(qū)內(nèi)葡萄的氨基酸組成，針對(duì)性地補(bǔ)充發(fā)酵體系中的“短板”氨基酸具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。此外，發(fā)酵基質(zhì)中無機(jī)氮源的含量及補(bǔ)充時(shí)間[38]、有機(jī)氮源與無機(jī)氮源的組成及比例[39]等對(duì)葡萄酒果香酯類的含量也具有明顯影響，而本研究未涉及無機(jī)氮源的考察。因此，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究，明確葡萄果實(shí)及葡萄發(fā)酵體系中以氨基酸為主的有機(jī)氮源的組成對(duì)葡萄酒果香酯類的影響，進(jìn)一步闡釋氨基酸對(duì)果香酯類生成的作用機(jī)理，為基于發(fā)酵氮營養(yǎng)調(diào)控的果酒增香釀造技術(shù)的開發(fā)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

刺葡萄中除脯氨酸外的總氨基酸含量是‘赤霞珠’葡萄的3倍，刺葡萄中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、纈氨酸含量高于‘赤霞珠’，但丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量顯著低于‘赤霞珠’。刺葡萄發(fā)酵酒中的乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯和中鏈脂肪酸乙酯含量顯著低于‘赤霞珠’。氨基酸與果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性分析顯示，刺葡萄中丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性低于‘赤霞珠’中上述氨基酸與果香酯類物質(zhì)的相關(guān)性，這可能是導(dǎo)致刺葡萄酒中果香酯類物質(zhì)含量顯著偏低的原因。

致謝：感謝西北農(nóng)林科技大學(xué)測(cè)試中心李愛華老師為本研究提供的儀器分析技術(shù)支持。

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Correlation Analysis Between Amino Acids and Fruity Esters During Spine Grape Fermentation

ZHU ZiJian1, CHEN SiYu1, SU Jun2, TAO YongSheng1, 3

(1College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2Hunan Research Center of Spine Grapes, Hongjiang 418200, Hunan;3Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, Shaanxi)

【】The aim of this study was to reveal the correlation between amino acid composition and fruity ester production during fermentation of spine grapes, so as to provide the theoretical guidance for aroma enhancement fermentation of spine grape wine.【】A spine grape variety, Xiangzhenzhu, was used to conduct alcoholic fermentation with, and Cabernet Sauvignon grape was served as control. During fermentation, sampling was carried out every 24 h to analyze the concentrations of amino acids and esters by using HPLC and GC-MS, respectively. Furthermore, the mathematical relationship between these two parameters was analyzed by Pearson correlation analysis.【】Total content of amino acids (except proline) in spine grape was 3 folds higher than that in Cabernet Sauvignon grape, with 2.4, 2.2, 4.2, 7.7 and 3 folds for aspartic acid, valine, glutamic acid, γ-aminobutyric acid and arginine, respectively. However, the content of alanine, phenylalanine and isoleucine in spine grape only accounted for 10%, 35% and 20%, respectively. Compared with Cabernet Sauvignon, fermentation with spine grape only produced 55%, 11% and 69% in the concentrations of acetates, short-chain fatty acid ethyl esters, and medium-chain fatty acid ethyl esters, respectively. Pearson correlation analysis further showed that the correlation coefficient between alanine, phenylalanine, isoleucine and acetate, fatty acid ethyl ester was 0.552-0.837 during fermentation with spine grape, which was significantly lower than that of Cabernet Sauvignon.This might be related to low content of fruity esters in spine grape wine.【】Low content of alanine, phenylalanine and isoleucine could negatively affect ester productions during alcoholic fermentation.

wine; spine grape; amino acid; fruity ester; correlation analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.11.013

2019-09-30；

2019-12-16

國家自然科學(xué)基金（31972199）、陜西省杰出青年科學(xué)基金（2020JC-22）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（2452019182）

朱子健，E-mail：zhuzijian@nwafu.edu.cn。通信作者陶永勝，E-mail：taoyongsheng@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）