越來越多的研究表明，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）進(jìn)程是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制，而微小RNA（microRNA，miRNA）在此過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1-3]。miR-363-3p是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的miRNA，在結(jié)直腸癌、胃癌和甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4-6]。有學(xué)者指出，miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌中異常低表達(dá)，且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但其在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用并不明確[7]。采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-363-3p 與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TWIST13'UTR存在互補的核苷酸序列，可能通過靶向TWIST1調(diào)控EMT進(jìn)程影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為研究對象，通過觀察miR-363-3p和TWIST1的關(guān)系，旨在闡明miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌EMT進(jìn)程和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用，為改善和治療非小細(xì)胞肺癌提供新的線索。

材料與方法

一、材料

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；胎牛血清（貨號2104，杭州四季青公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號C22400500BT，美國Gibco公司）；胰蛋白酶（貨號T0458，上海生工生物公司）；β-actin抗體（貨號ET1702-52，華安生物公司）；TWIST1抗體（貨號T6454MSDS，美國Sigma公司），Vimentin抗體（貨號5741）、E-cadherin抗體（貨號3195，美國Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗（貨號926-32221，美國Li-Cor公司）；LipofectamineTM2000（貨號11668-027，美國Introvgen公司）；Matrigel基質(zhì)（貨號356237，美國BD公司）；Transwell板（美國Corning公司）；PVDF膜（美國Bio-Rad公司）；miR-363-3p模擬物、miR-363-3p抑制劑及相應(yīng)的陰性對照（上海GenePharma公司）；pcDNA3.1-TWIST1 過表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒（長沙贏潤生物技術(shù)公司）；Dual-luciferase檢測試劑盒說明書（美國Promega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（中國Beyotime公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染：人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。采用含100 ml/L胎牛血的RPMI-1640培養(yǎng)基于5﹪CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為：空白對照組（細(xì)胞未做任何處理）；模擬物對照組（轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物陰性對照）；模擬物組（轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物）；每組設(shè)置3個平行孔。轉(zhuǎn)染前24 h，將長勢良好的對數(shù)生長期A549細(xì)胞按照每孔6×105個細(xì)胞平鋪于6孔細(xì)胞板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟按照實驗分組將50 μmol/L的miRNA試劑轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。待轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組A549細(xì)胞進(jìn)行實驗。后期實驗另設(shè)：模擬物+pcDNA組（轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物和pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒）、模擬物+TWIST1組（轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物和pcDNA3.1-TWIST1過表達(dá)質(zhì)粒），每組設(shè)置3個平行孔。以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染后，收集各組細(xì)胞，采用進(jìn)行 Western blot和Transwell 小室實驗分別檢測TWIST1過表達(dá)對miR-363-3p 高表達(dá)的A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的影響。

2.RT-PCR檢測miR-363-3p和TWIST1mRNA的表達(dá)：以Trizol 法提取待測A549細(xì)胞的總RNA后，采用Nanodrop 2000分析總RNA純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并將所得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，U6或β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴增，miR-363-3p和TWIST1mRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計算。其中，由北京Tiangen Biotech公司合成的miR-363-3p、U6、TWIST1、β-actin 引物序列見表1。實驗重復(fù)3次。

3.Western blot檢測TWIST1和EMT相關(guān)蛋白Vimentin、E-cadherin的表達(dá)：向待測的A549細(xì)胞中加入裂解液裂解細(xì)胞獲取總蛋白，并采用Bradford法對總蛋白定量。將其與上樣緩沖液混合均勻后，置于沸水浴中煮沸3～5 min。按照每孔60 μg蛋白樣品上樣行SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)至PVDF膜后，以含有50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉1.5 h。加入1:500 稀釋的一抗工作液4℃下結(jié)合反應(yīng)24 h。次日經(jīng)TBST溶液洗膜后，置于1:2 000稀釋的二抗工作液中常溫反應(yīng)1 h。顯影后，采用Image 軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)水平。目的蛋白的相對表達(dá)水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參β-actin條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

4.Transwell 小室實驗檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力：侵襲實驗：（1）將以培養(yǎng)液稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠按照每孔80 μL 平鋪于Transwell 小室的上室，37℃下充分融合備用；（2）取24孔細(xì)胞板加入600 μL 含10﹪胎牛血清的培養(yǎng)基，放上Transwell小室，并于上室內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μL（細(xì)胞數(shù)為4×103個）；（3）放入培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h；（4）將Transwell小室取出，采用4﹪多聚甲醛對轉(zhuǎn)移并附著在上室下表面的細(xì)胞固定10～15 min，并以1 g/L結(jié)晶紫染色10～20 min；（5）洗去染色液后，風(fēng)干并以顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果以隨機選取的6個高視野視野中細(xì)胞數(shù)的均值表示。遷移實驗：同侵襲實驗步驟相似，無需進(jìn)行第1步。實驗重復(fù)3次。

5.miR-363-3p和TWIST1靶向關(guān)系的驗證：轉(zhuǎn)染前24 h，將長勢良好的對數(shù)生長期A549細(xì)胞以105個/孔的密度接種至12孔細(xì)胞板上，待細(xì)胞生長至70﹪融合度時，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟將百奧邁科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的野生型（TWIST1-WT）和突變型（TWIST1-MUT）的TWIST13'-UTR 雙熒光報告質(zhì)粒分別與miR-363-3p模擬物/抑制劑和相應(yīng)陰性對照共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。每組設(shè)置3個平行孔。轉(zhuǎn)染48 h后，參照Dual-luciferase檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，A549細(xì)胞中miR-363-3p、TWIST1、Vimentin和E-cadherin表達(dá)水平、熒光素酶活性、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miR-363-3p表達(dá)升高而TWIST1表達(dá)降低

與空白對照組和模擬物對照組比較，模擬物組A549細(xì)胞中miR-363-3p表達(dá)水平升高，TWIST1mRNA和蛋白的表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；而空白對照組和模擬物對照組之間的miR-363-3p表達(dá)水平、TWIST1mRNA和蛋白的表達(dá)水平之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。（圖1、表2）

圖1 Western blot檢測TWIST1蛋白的表達(dá)

表2 模擬物干預(yù)后A549細(xì)胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表達(dá)水平（±s，n = 3）

表2 模擬物干預(yù)后A549細(xì)胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表達(dá)水平（±s，n = 3）

注：與空白對照組比較，aP ＜0.001；與模擬物對照組比較，bP ＜0.001；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 miR-363-3p表達(dá)量TWIST1 mRNA表達(dá)量TWIST1蛋白表達(dá)量空白對照組 1.00±0.08 1.00±0.06 0.81±0.05模擬物對照組 0.97±0.05 0.98±0.06 0.78±0.06模擬物組 3.82±0.45ab 0.39±0.02ab 0.42±0.02ab F值 114.067 142.223 65.215 P值＜0.001＜0.001＜0.001

二、TWIST1是miR-363-3p潛在的靶基因

采用TargetScan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TWIST13' UTR區(qū)域有能夠與miR-363-3p 互補結(jié)合的核苷酸序列（圖2）。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)，與模擬物對照組比較，模擬物組TWIST1-WT活性（1.00±0.10 比0.42±0.04）降低（t= 9.327，P= 0.001），與抑制劑對照組比較，抑制劑組TWIST1-WT活性（1.08±0.07比2.96±0.30）增高（t= 10.570，P＜0.001）。（圖3）

圖2 TWIST1 3' UTR 與miR-363-3p的結(jié)合位點

圖3 模擬物及抑制劑干預(yù)細(xì)胞后雙熒光素酶相對活性

三、miR-363-3p過表達(dá)抑制A549細(xì)胞EMT進(jìn)程

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和模擬物對照組比較，模擬物組A549細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與空白對照組比較，模擬物對照組Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；與模擬物對照組比較，模擬物組A549細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。（圖4、表3）

圖4 Western blot檢測Vimentin和E-cadherin蛋白的表達(dá)

表3 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相對表達(dá)水平（±s，n = 3）

表3 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相對表達(dá)水平（±s，n = 3）

注：與空白對照組比較，aP ＜0.001；與模擬物對照組比較，bP ＜0.001；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 Vimentin蛋白表達(dá)量 E-cadherin蛋白表達(dá)量空白對照組 0.58±0.04 0.22±0.02模擬物對照組 0.55±0.05 0.25±0.03模擬物組 0.36±0.03ab 0.47±0.03ab F值 25.620 76.227 P值 0.001＜0.001

四、miR-363-3p過表達(dá)抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell 實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和模擬物對照組比較，模擬物組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與空白對照組比較，模擬物對照組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞ 0.05）；與模擬物對照組比較，模擬物組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。（表4、圖5）

表4 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響（±s，n = 3）

表4 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響（±s，n = 3）

注：與空白對照組比較，aP ＜0.001；與模擬物對照組比較，bP ＜0.001；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組遷移細(xì)胞數(shù)（個）侵襲細(xì)胞數(shù)（個）空白對照組 85.75±5.45 128.26±6.15模擬物對照組 83.52±6.85 125.95±8.05模擬物組 53.05±4.50ab 71.64±5.75ab F值 30.990 68.106 P值＜0.001＜0.001

五、TWIST1逆轉(zhuǎn)miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的抑制作用

與模擬物+pcDNA3.1組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TWIST1過表達(dá)質(zhì)粒后，miR-363-3p過表達(dá)的A549細(xì)胞中Vimentin蛋白的表達(dá)水平升高，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，A549細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)增加（P均＜0.05）。（圖6～圖7和表5）

討 論

表5 TWIST1 對miR-363-3p過表達(dá)的A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的影響（±s，n = 3）

表5 TWIST1 對miR-363-3p過表達(dá)的A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的影響（±s，n = 3）

分組 Vimentin蛋白表達(dá)量 E-cadherin蛋白表達(dá)量遷移細(xì)胞數(shù)（個）侵襲細(xì)胞數(shù)（個）模擬物+pcDNA3.1組 0.32±0.02 0.56±0.04 49.45±4.22 72.45±5.73模擬物+TWIST1組 0.42±0.03 0.38±0.03 67.52±5.05 108.35±6.56 t 值 4.804 6.235 4.756 7.139 P值 0.009 0.003 0.009 0.002

圖7 Western blot檢測Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)

EMT是賦予腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的生物學(xué)過程，被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主因。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNA 如miR-330、miR-4472和miR-194-5p 等在調(diào)控EMT過程中發(fā)揮著重要作用[8-10]。miR-363-3p是一個值得關(guān)注的miRNA，被認(rèn)為具有潛在的抑瘤作用。miR-363-3p 高表達(dá)被認(rèn)為是宮頸腺癌預(yù)后良好的重要預(yù)測指標(biāo)[11]；腎癌中miR-363-3p表達(dá)缺失時可使致癌基因CREB1過表達(dá)，而引入miR-363-3p可通過下調(diào)CREB1表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移[12]。另外，有學(xué)者指出，miR-363-3p 在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中經(jīng)常下調(diào)，而下調(diào)miR-363-3p表達(dá)可通過靶向Sox4誘導(dǎo)EMT進(jìn)程，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。

本研究采用TargetScan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TWIST13' UTR區(qū)域有能夠與miR-363-3p 互補結(jié)合的核苷酸序列，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測證實TWIST1是miR-363-3p的潛在靶基因。TWIST1是一種可誘導(dǎo)腫瘤EMT 過程的核轉(zhuǎn)錄因子，與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[13]。TWIST1在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，在癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用；另外減少TWIST1表達(dá)可通過抑制EMT 間質(zhì)蛋白N-cadherin表達(dá)抑制癌細(xì)胞侵襲[14-16]。有研究指出，miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌組織中異常低表達(dá)，且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，可通過靶向PCNA抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其是否通過靶向TWIST1調(diào)控EMT進(jìn)程進(jìn)而影響非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移[7,17]。

E-cadherin表達(dá)減少和Vimentin表達(dá)增多常被認(rèn)為是發(fā)生EMT的重要標(biāo)志[18-20]。有研究指出，E-cadherin 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)降低，而Vimentin 則相反，EMT 可能在非小細(xì)胞肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[21]。通過構(gòu)建miR-363-3p過表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株，本研究發(fā)現(xiàn)miR-363-3p過表達(dá)可引起TWIST1和Vimentin表達(dá)降低，而E-cadherin表達(dá)升高，抑制EMT進(jìn)程；同時，miR-363-3p過表達(dá)可明顯減弱A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，TWIST1過表達(dá)后，miR-363-3p 對A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的抑制作用得以逆轉(zhuǎn)。提示，miR-363-3p 可通過靶向TWIST1調(diào)控EMT抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，TWIST1 基因可能通過抑制Ecadherin蛋白表達(dá)，上調(diào)Vimentin蛋白表達(dá)促進(jìn)了EMT，進(jìn)而增強腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[22-23]。然而其可能的機制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用，而靶向TWIST1抑制EMT進(jìn)程是其重要的機制之一。然而，非小細(xì)胞肺癌惡性轉(zhuǎn)移的分子機制十分復(fù)雜，如何更全面的闡明miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用還有待深入研究。