王磊 艾文 方葉青 陳之杰 邱小燕 李華英 謝培益

心腦血管疾病已成為當(dāng)今社會最主要的致死和致殘疾病，嚴重危害人類健康和生活質(zhì)量，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是血管系統(tǒng)疾病的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)生機制復(fù)雜，內(nèi)皮細胞損傷和炎癥因子均與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1]，研究AS 發(fā)生發(fā)展的分子機制，制定有效的預(yù)防和治療措施，對提高AS整體防治水平具有重要意義[2]。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與血管炎癥、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞密切相關(guān)，在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。HOXA 反義RNA 2（HOXA cluster antisense RNA 2，HOXA-AS2）是一種lncRNA，研究顯示HOXA-AS2可抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤行為和血管擬態(tài)形成[4]，HOXA-AS2 敲低可抑制非小細胞肺癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡并抑制遷移和侵襲[5]，HOXA-AS2通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)的激活抑制內(nèi)皮炎癥[6]，然而HOXA-AS2對AS模型細胞生物學(xué)功能、炎癥因子的影響及其機制尚不清楚。miRNA 也參與調(diào)控AS形成、發(fā)展的病理生理過程，在AS 中也起重要作用[7]，研究顯示miR-17 在AS患者的血液中高表達，通過靶向自噬相關(guān)基因7（autophagy related gene 7，ATG7）促進巨噬細胞凋亡和炎癥因子的表達[8]，miR-17 高表達于冠心病患者血清，與患者冠狀動脈病變程度、側(cè)支循環(huán)形成及血清氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）水平密切相關(guān)[9]，抑制miR-17-5p通過上調(diào)ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1（ATPbinding cassette transporterA1，ABCA1）減少巨噬細胞RAW264.7 中炎癥因子的產(chǎn)生和脂質(zhì)積聚[10]，但miR-17對AS模型細胞生物學(xué)功能以及炎癥因子的影響尚未清楚。本實驗旨在研究HOXA-AS2靶向miR-17對AS模型細胞生物學(xué)功能、炎癥因子的影響及其機制。

材料與方法

一、材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy926（上海莼試生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）（廣州奕源生物科技有限公司）；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（美國Progema公司）；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京Solarbio公司）；抗體（武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ELISA）（上海繼錦化學(xué)科技有限公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）；CO2孵育箱、Thermo FC酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國Bio-Rad公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：EA.hy926細胞用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5﹪ CO2條件下培養(yǎng)，2 d換液1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.細胞處理與分組：按照參考文獻[11]的處理方法對細胞進行處理分組；一共分為4個實驗；實驗1：用100μg/mL的ox-LDL處理EA.hy926細胞作為ox-LDL組，正常培養(yǎng)的細胞作為對照組；實驗2：將pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2轉(zhuǎn)染至EA.hy926細胞中再用100μg/mL的ox-LDL處理，記為ox-LDL+pcDNA3.1組、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組；實驗3：將pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2、si-NC、si-HOXA-AS2分別轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-HOXA-AS2組、si-NC組、si-HOXA-AS2組；實驗4：將pcDNA3.1-HOXA-AS2 與miR-NC、miR-17分別共轉(zhuǎn)染至EA.hy926細胞中再用100μg/mL的ox-LDL處理，記為ox-LDL+pcDNA3.1-HOXAAS2+miR-NC組、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXAAS2+miR-17組。

3.實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測HOXA-AS2和miR-17的表達水平：各組細胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。HOXA-AS2和miR-17分別以GAPDH和U6為內(nèi)參。（表1）

表1 引物序列信息

4.蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測P21、cleaved caspase 3、caspase3蛋白表達：提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。各組蛋白上樣量60 μg，SDS-PAGE后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上。用5﹪脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影液，最后洗去殘液，晾干，將膠片用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

5.MTT檢測細胞增殖情況：在各組細胞培養(yǎng)48 h時，每孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度（OD）值。細胞增殖率（﹪）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100﹪。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

6.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：各組細胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS 漂洗2次，與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

7.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測IL-1、IL-6水平：各組細胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進行檢測。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

8.熒光素酶報告實驗檢測HOXA-AS2對miR-17的靶向調(diào)控：構(gòu)建野生型和突變型基因靶點HOXA-AS2的熒光素酶表達載體WT-HOXA-AS2和MUT-HOXA-AS2，用LipofectamineTM2000 將WT-HOXA-AS2和MUT-HOXA-AS2分別與miRNC、miR-17、anti-miR-NC、anti-miR-17共轉(zhuǎn)染至EA.hy926細胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，HOXA-AS2、miR-17、P21、cleaved caspase 3、caspase3 相對表達水平，細胞增殖率，細胞凋亡率，IL-1和IL-6水平用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HOXA-AS2在ox-LDL作用的EA.hy926細胞中的表達

與對照組比較，ox-LDL組EA.hy926細胞中HOXA-AS2表達水平及細胞增殖率降低，P21、cleaved caspase3、caspase3表達水平和細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1，表2）。

圖1 對照組與ox-LDL組細胞相關(guān)指標(biāo)的差異

二、過表達HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞增殖、凋亡的影響

與ox-LDL+pcDNA3.1組比較，ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組EA.hy926細胞中HOXAAS2表達水平和細胞增殖率升高，P21、cleaved caspase 3、caspase3表達水平和細胞凋亡率降低（P＜0.05，圖2，表3）。

三、過表達HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞中IL-1和IL-6表達的影響

與對照組比較，ox-LDL組EA.hy92細胞6中IL-1、IL-6水平升高（t= 11.752、11.675，P均＜0.001）；與ox-LDL+pcDNA3.1組比較，ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組EA.hy926細胞中IL-1、IL-6水平降低（t= 8.085、8.911，P＜0.001）（表4）。

表2 HOXA-AS2的表達及ox-LDL處理對EA.hy926細胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3蛋白表達的影響（±s，n = 3）

表2 HOXA-AS2的表達及ox-LDL處理對EA.hy926細胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3蛋白表達的影響（±s，n = 3）

注：n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 HOXA-AS2 P21 cleaved caspase 3 caspase 3增殖率（﹪）凋亡率（﹪）對照組 1.02±0.10 0.20±0.02 0.14±0.01 0.26±0.03 100.06±10.20 8.23±0.80 ox-LDL組 0.23±0.02 0.82±0.08 0.67±0.06 0.89±0.08 47.83± 5.01 26.81±2.47 t 值 13.417 13.023 15.092 12.771 7.961 12.395 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001＜0.001

圖2 過表達HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞增殖、凋亡的影響

表3 過表達HOXA-AS2對ox-LDL處理的EA.hy926細胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3、caspase3蛋白表達的影響（±s，n = 3）

表3 過表達HOXA-AS2對ox-LDL處理的EA.hy926細胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3、caspase3蛋白表達的影響（±s，n = 3）

注：n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 HOXA-AS2 P21 cleaved caspase 3 caspase 3增殖率（﹪）凋亡率（﹪）ox-LDL+pcDNA3.1組 0.22±0.02 0.81±0.08 0.69±0.06 0.88±0.08 48.21±4.86 26.83±2.48 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組 0.87±0.09 0.33±0.03 0.24±0.02 0.42±0.04 89.94±8.34 12.33±1.18 t 值 12.211 9.731 12.324 8.908 7.488 9.145 P值＜0.001 0.001＜0.001 0.001 0.002 0.001

表4 過表達HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞中IL-1和IL-6表達的影響（±s，n = 3）

表4 過表達HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞中IL-1和IL-6表達的影響（±s，n = 3）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與ox-LDL組比較,bP ＜0.05；與ox-LDL+pcDNA3.1組比較，cP ＜0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 IL-1（ng/L）IL-6（ng/L）對照組 326.14±34.59 19.25±2.11 ox-LDL組 792.34±59.37a 53.67±4.65a ox-LDL+pcDNA3.1組 802.21±60.18a 55.21±5.10a ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組 446.25±46.84bc 25.64±2.65bc F值 200.722 212.214 P值＜0.001＜0.001

四、HOXA-AS2靶向調(diào)控miR-17

Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示HOXA-AS2 與miR-17存在結(jié)合位點（圖3）。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組比較，miR-17組中轉(zhuǎn)染野生型表達載體WT-HOXA-AS2的EA.hy926細胞熒光素酶活性降低（t= 11.281，P＜0.05），而轉(zhuǎn)染突變型表達載體MUT-HOXA-AS2的EA.hy926細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-17組中轉(zhuǎn)染野生型表達載體WT-HOXAAS2的EA.hy926細胞熒光素酶活性升高（t= 9.606，P＜0.05），而轉(zhuǎn)染突變型表達載體MUT-HOXAAS2的EA.hy926細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表5）。miR-17表達水平比較，pcDNA3.1-HOXA-AS2組（0.34±0.03）比pcDNA3.1組（1.04±0.10）降低，si-HOXA-AS2組（2.14±0.22）比si-NC組（0.99±0.10）升高（P均＜0.05）。

五、過表達miR-17能逆轉(zhuǎn)HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞增殖、凋亡及IL-1和IL-6表達的影響

與ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17組比較，ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組和ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC組EA.hy926細胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3表達水平和細胞凋亡率降低，IL-1和IL-6水平和細胞增殖率升高（P＜0.05），ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組和ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC組之間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4，表6～7）。

圖3 HOXA-AS2靶向miR-17

表5 雙熒光素酶報告實驗對HOXA-AS2和miR-17靶向關(guān)系的驗證（±s，n = 3）

表5 雙熒光素酶報告實驗對HOXA-AS2和miR-17靶向關(guān)系的驗證（±s，n = 3）

注：與miR-NC組比較，aP ＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP ＜0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 WT-HOXA-AS2 MUT-HOXA-AS2 miR-NC組 1.01±0.10 0.94±0.09 miR-17組 0.33±0.03a 1.02±0.10 anti-miR-NC組 1.00±0.10 1.01±0.10 anti-miR-17組 2.29±0.21b 0.99±0.10 F值 123.931 0.399 P值＜0.001 0.758

圖4 過表達miR-17 在HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞增殖、凋亡中的影響

表6 過表達miR-17能逆轉(zhuǎn)HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞中IL-1和IL-6表達及細胞增殖率的影響（±s，n = 3）

表6 過表達miR-17能逆轉(zhuǎn)HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞中IL-1和IL-6表達及細胞增殖率的影響（±s，n = 3）

注：與ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組比較，aP ＜0.05；與ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC組比較，bP ＜0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組細胞增殖率（﹪）IL-1（ng/L）IL-6（ng/L）ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組 90.23±9.24 452.01±42.96 26.14±2.42 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC組 90.21±9.16 451.21±43.58 26.11±2.39 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17組 53.67±5.46ab 684.26±62.38ab 41.29±4.37ab F值 20.130 21.265 22.499 P值 0.002 0.002 0.002

表7 過表達miR-17能逆轉(zhuǎn)HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3 及凋亡率的影響（±s，n = 3）

表7 過表達miR-17能逆轉(zhuǎn)HOXA-AS2對ox-LDL作用的EA.hy926細胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3 及凋亡率的影響（±s，n = 3）

注：與ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組比較，aP ＜0.05；與ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC組比較，bP ＜0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 P21 cleaved caspase 3 caspase 3 凋亡率（﹪）ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2組 0.31±0.03 0.26±0.02 0.41±0.04 12.55±1.35 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC組 0.32±0.03 0.27±0.02 0.42±0.04 12.63±1.42 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17組 0.73±0.07ab 0.56±0.05ab 0.79±0.07ab 23.31±1.95ab F值 77.149 79.182 52.111 45.119 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

討 論

AS屬于常見的血管病變，有著較高的發(fā)病率與死亡率，盡早診斷與治療對于改善患者的預(yù)后，提高生活質(zhì)量有著積極的意義[12]。血管炎癥、內(nèi)皮細胞功能損傷與障礙均與AS密切相關(guān)，深入研究其相關(guān)機制對防治AS以及進一步防治相關(guān)疾病意義重大[13]。研究顯示，內(nèi)皮細胞功能損傷可促使多種炎性因子的分泌及粥樣斑塊形成[14]。炎性相關(guān)因子也參與了AS的形成發(fā)展過程，AS模型大鼠血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）高表達[15]。本實驗用ox-LDL作用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy926結(jié)果顯示，細胞增殖率降低，細胞凋亡率、IL-1、IL-6水平升高。說明ox-LDL 可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷和炎癥因子的釋放，表明AS細胞模型建立成功。

研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 參與調(diào)節(jié)AS的發(fā)生發(fā)展[16]。敲低HOXA-AS2 可通過抑制細胞增殖并加速凋亡來抑制乳頭狀甲狀腺癌的進展[17]。敲低HOXAAS2抑制肝細胞癌增殖，并促進細胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL作用的EA.hy926細胞中HOXA-AS2表達水平降低，然而HOXA-AS2對AS的影響尚未可知。本實驗通過轉(zhuǎn)染HOXA-AS2過表達載體至ox-LDL作用的EA.hy926細胞中，研究HOXA-AS2對AS細胞模型的增殖、凋亡和炎性因子的影響，結(jié)果顯示，ox-LDL作用的EA.hy926細胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3表達水平、細胞凋亡率降低，細胞增殖率升高，IL-1、IL-6水平降低。說明過表達HOXA-AS2 促進EA.hy926細胞增殖，抑制ox-LDL作用的EA.hy926細胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生。

有研究顯示，過表達miR-17 可通過靶向胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）促進細胞增殖并抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡[19]。抑制miR-17-5p 可以通過減輕AS小鼠主動脈的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平緩解AS 病變[20]。說明miR-17具有調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。此外，還有研究報道LncRNA SNHG16通過miR-17-5p/NF-κB信號通路促進AS患者巨噬細胞的增殖和炎癥反應(yīng)[21]。說明lncRNA可通過調(diào)控miR-17影響細胞的生物學(xué)行為，本實驗用Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示HOXA-AS2與miR-17存在結(jié)合位點，進一步通過雙熒光素酶報告實驗驗證表明HOXAAS2 可靶向調(diào)控miR-17的表達。本實驗結(jié)果顯示，ox-LDL作用的EA.hy926細胞中miR-17高表達，同時過表達miR-17和HOXA-AS2后，P21、cleaved caspase 3、caspase 3表達水平、細胞凋亡率、IL-1和IL-6水平升高，細胞增殖率降低，說明過表達miR-17逆轉(zhuǎn)了HOXA-AS2過表達對ox-LDL作用的EA.hy926細胞增殖、凋亡及炎性因子的影響，提示HOXA-AS2可能通過調(diào)控miR-17影響ox-LDL作用的EA.hy926細胞增殖、凋亡及炎性因子水平。

綜上所述，過表達HOXA-AS2可促進細胞增殖，抑制ox-LDL作用的細胞凋亡和炎癥因子的釋放，其機制可能與miR-17有關(guān)。