郭桃英 ，徐海英 ，陳文娟 ，潘玫 ，吳謀喜 ，代翔

（1.江西省九江市婦幼保健院婦科，九江 332000；2.江西省婦幼保健院腫瘤科，南昌 332000）

卵巢上皮性癌 (epithelial ovarian cancer，EOC)是全球女性生殖細(xì)胞最常見的惡性腫瘤之一[1]，約占卵巢惡性腫瘤的90%，惡性程度高，病情發(fā)展快，患者的五年生存率約為30%-40%[2,3]。早期篩查有可能大大降低EOC的死亡率[4]。卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因失活等多種分子改變。研究發(fā)現(xiàn)，HER-2作為一種促癌基因,與轉(zhuǎn)錄因子EGR-1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對判斷卵巢癌的預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義[5]。因此，尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物以進(jìn)行早期診斷和對其進(jìn)行靶向治療是非常必要的。

微小RNA（miRNA）是一種非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因表達(dá)[6]。miRNA通過細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲影響癌癥的發(fā)展[7]。近來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-183的表達(dá)與癌癥的預(yù)后相關(guān)，能調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖以及提高抗腫瘤藥物在EOC中的敏感性[8]。miRNA-100的表達(dá)降低和miRNA-203表達(dá)增加與EOC的進(jìn)展及預(yù)后不良有關(guān)[9]。有研究報(bào)道，miR-1294已被發(fā)現(xiàn)為某些腫瘤中的腫瘤抑制因子，miR-1294通過直接調(diào)節(jié)TPX2抑制細(xì)胞增殖并增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的化療敏感性[10]。miR-1294的表達(dá)下調(diào)能提高c-MYC表達(dá)，與食管鱗癌患者的預(yù)后不良有關(guān)[11]。目前有關(guān)miR-1294與上皮性卵巢癌的研究尚未見報(bào)道。本研究擬探討miR-1294與上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖能力的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞株 SW626，A2780，SKOV3，OVCAR3及卵巢表面上皮細(xì)胞系（HOSEpiC）購于中國科學(xué)院上海生物科學(xué)所細(xì)胞庫。脂質(zhì)體Lipofectamine3000 Reagent購自美國Invitrogen 公 司 ，hsa-miR-1294mimics，hsa-miR-1294 inhibitor及mimics NC、inhibitor NC均由廣州銳博生物科技有限公司合成和純化。所有細(xì)胞在DMEM 培 養(yǎng) 基 （DMEM，Gibco，Gaithersburg，MD，USA）中培養(yǎng)，在37℃、含有5%CO2的加濕環(huán)境下 補(bǔ) 充 10%胎 牛 血 清（FBS，Gibco，Gaithersburg，MD，USA）。細(xì)胞貼壁生長，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化分散細(xì)胞，每3d傳代一次。

1.2 qRT-PCR檢測miRNA-1294的表達(dá) 根據(jù)使用說明，使用 Trizol試劑（TaKaRa，Dalian，China）提取總RNA。使用Prime Script RT Reagent試劑盒（Takara，Dalian，China） 加 入 1μg 總 RNA 合 成cDNA。 采用 SYBR Premix ExTaqTM II（TaKaRa，Dalian，China）對miR-1294的表達(dá)水平進(jìn)行分析。使用ABI PRISM 7000序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA） 檢測 miR-1294的表達(dá)。qRT-PCR的反應(yīng)條件如下：95℃，10min，然后 95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s，40 個循環(huán)。U6表達(dá)用作內(nèi)對照。miR-1294的引物如下：miR-1294- 正 向 ：5'-TATGATCTCACCGAGTCCT-3'，miR-1294-反向：5'-TATGATCTCACCGAGTCCT-3'。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算倍數(shù)變化。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取相對低表達(dá)miR-1294的細(xì)胞株SKOV3和OVCAR3，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染mimics NC作為過表達(dá)的對照組，hsa-miR-1294mimics作為過表達(dá)組；轉(zhuǎn)染inhibitor NC作為抑制對照組，hsa-miR-1294 inhibitor作為抑制組。使用相同體積的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染Lipofectamine 3000作為空白對照組。轉(zhuǎn)染8 h后，10%胎牛血清的DMEM換為無血清培養(yǎng)基，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞株的miR-1294表達(dá)情況。其值越高，表示該細(xì)胞株的miR-1294表達(dá)量越高。

1.4 CCK 8法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的SKOV3 和 OVCAR3（2×104/孔）細(xì)胞接種到 96 孔板中,37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h,48h,72h和96h。隨后,將CCK8溶液加入每個孔中并再陪育2h。使用微量滴定板讀數(shù)器 （Tecan Infinite 200 PRO;Salzburg，Austria）檢測細(xì)胞增殖,吸光度為 450nm。其吸光度越高表示細(xì)胞株的增殖率越高。

1.5 細(xì)胞周期分析 將轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞株SKOV3和OVCAR3及空白對照組細(xì)胞用于細(xì)胞周期分析。細(xì)胞在4℃，冰冷的70%乙醇中固定一整晚。然后用50g/L PI染色，50g/L RNase處理。使用流式細(xì)胞儀 （FACScan;BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分析細(xì)胞周期。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，研究結(jié)果數(shù)據(jù)表示為正態(tài)分布計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間差異采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系中miR-1294表達(dá)量 qRT-PCR檢 測 卵 巢 癌 細(xì) 胞 系 SW626，A2780，SKOV3 和OVCAR3及卵巢表面上皮細(xì)胞系 （HOSEpiC）中miR-1294的相對表達(dá)量，HOSEpiC細(xì)胞系相對表達(dá)量為 1.00883±0.25393，SW626細(xì)胞系相對表達(dá)量為0.62309±0.15175，A2780細(xì)胞系相對表達(dá)量為0.56157±0.12126,OVCAR3細(xì)胞系相對表達(dá)量為0.45055±0.09466；SKOV3細(xì)胞系相對表達(dá)量為0.4677±0.12181。miR-1294在卵巢癌細(xì)胞系SW626，A2780，SKOV3和 OVCAR3 中的表達(dá)明顯低于卵巢表面上皮細(xì)胞系（HOSEpiC），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)，這提示miR-1294可能在卵巢癌組織中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

圖1 qRT-PCR驗(yàn)證卵巢癌細(xì)胞系及卵巢表面上皮細(xì)胞系（HOSEpiC）中miR-1294的表達(dá)

2.2 miR-1294對上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1294 mimics后的OVCAR3細(xì)胞系及SKOV3細(xì)胞系增殖能力顯著被抑制，在轉(zhuǎn)染24h、48h及72h相比于空白對照組和mimics NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染miR-1294 inhibitor后的OVCAR3細(xì)胞系及SKOV3細(xì)胞系24h、48h及72h相比于空白對照組和inhibitor NC組，能有效促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖活性 (P＜0.05，見圖2、圖 3)。

圖2 cck-8法檢測miR-1294對OVCAR3卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 cck-8法檢測miR-1294對SKOV3卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 miR-1294對卵巢癌細(xì)胞增殖周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-1294mimics的OVCAR3細(xì)胞系與miR-1294mimics NC組比較，其S期細(xì)胞平均比例分別為 (15.74±1.38)%和(27.61±2.59)%，G1期細(xì)胞比例分別為(69.11±3.28)%和(53.47±4.34)%。轉(zhuǎn)染miR-1294mimics的OVCAR3細(xì)胞系S期細(xì)胞增殖指數(shù)較低，而停留在G1期的細(xì)胞比例則較高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖 4)。 轉(zhuǎn)染 miR-1294mimics的 SKOV3細(xì)胞系與空白對照組比較，其S期細(xì)胞平均比例分別為(15.37±0.91)%和(27.07±4.08)%，G1期細(xì)胞比例分別為 (69.09±2.05)%和 (54.02±3.20)%。轉(zhuǎn)染miR-1294mimics的SKOV3細(xì)胞系的細(xì)胞S期細(xì)胞增殖指數(shù)較低，而停留在G1期的細(xì)胞比例則較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-1294mimics對OVCAR3卵巢癌細(xì)胞周期的影響

圖5 轉(zhuǎn)染miR-1294mimics對SKOV3卵巢癌細(xì)胞周期的影響

3 討論

卵巢惡性腫瘤具有異質(zhì)性和多樣性。發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤第三位，但死亡率最高。由于缺乏早期安全和無創(chuàng)的檢測方法，患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多為晚期并提示高度惡性。因此，探討其發(fā)病機(jī)制及尋找有效治療方法至關(guān)重要。

近年來，有關(guān)EOC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步[12]。研究顯示，細(xì)胞增殖抑制基因Mfn2上調(diào)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖[13]。更多研究發(fā)現(xiàn)MircroRNA可作為診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。從腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面研究發(fā)現(xiàn)，miRNA發(fā)揮重要抑癌基因或癌基因作用[14-16]，就組織敏感性、特異性、降解難易度及檢測方便度來講，mi R NA是 腫瘤早期診斷、腫瘤標(biāo)志物及分子治療靶向的研究方向[17,18]。在EOC進(jìn)展中，miR-9通過靶向SDF-1/CXCR4途徑起到上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖的腫瘤抑制劑的作用[19]。miR-429的下調(diào)通過靶向ZEB1促進(jìn)上皮性卵巢癌耐藥性的發(fā)展[20]。MicroRNA-298通過調(diào)節(jié)EZH2的表達(dá)來抑制上皮性卵巢癌的惡性表型[21]。MiR-26b/KPNA2軸通過下調(diào)OCT4抑制上皮性卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移[22]。因此，這些證據(jù)表明，mircroRNA在EOC進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。但是，有關(guān)miR-1294在上皮性卵巢癌中的作用仍然未知。

在本研究中，我們以上皮性卵巢癌細(xì)胞系為研究對象，我們發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞株SW626，A2780，SKOV3和OVCAR3及卵巢表面上皮細(xì)胞系（HOSEpiC）中miR-1294均有表達(dá)，與HOSEpiC相比，SW626，A2780，SKOV3 和 OVCAR3 中的 miR-1294表達(dá)均較低。將miR-1294轉(zhuǎn)染至SKOV3和OVCAR細(xì)胞后，細(xì)胞增殖情況測定顯示，miR-1294過表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞周期分析顯示，miR-1294的過表達(dá)導(dǎo)致S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而停留在G1期的細(xì)胞比例則較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此，上述結(jié)果表明增加miR-1294表達(dá)能抑制EOC細(xì)胞生長。

綜上所述，miR-1294在上皮性卵巢癌的增殖與進(jìn)展中發(fā)揮著某些調(diào)節(jié)作用，這為探索上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的基因治療靶點(diǎn)提供了依據(jù)。