李鳳中，陳衛(wèi)國(guó)，劉劍榮，陳小林

（江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，1.檢驗(yàn)科；2.肝病科，萍鄉(xiāng) 337055）

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，有超過(guò)3.5億人是HBV的慢性攜帶者[1]。目前尚無(wú)可有效治療慢性乙型肝炎（CHB）的藥物。當(dāng)前臨床可用的藥物包括具有抗病毒活性和抑制HBV DNA 的核苷（酸）類(lèi)似物[2]，如恩替卡韋[3]，但大多數(shù)患者需要終身治療[4]。因此除了抗病毒藥物之外，尋找輔助性治療CHB的藥物尤為重要。25-羥維生素D3[25（OH）D3]由維生素D3前體在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)25-羥化作用合成，這個(gè)過(guò)程由兩種羥化酶催化，其均是細(xì)胞色素 （Cytochrome P450 proteins，CYP）的同工酶[5]，分別為肝細(xì)胞微粒體羥化酶CYP2R1和線(xiàn)粒體羥化酶CYP27A1，而正常情況下CYP2R1在合成25（OH）D3中發(fā)揮主導(dǎo)作用[6]。有研究表明，CHB患者血清25（OH）D3含量與HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān)[7,8]。也有研究表明，對(duì)CHB患者補(bǔ)充維生素D可以提高患者的抗病毒治療效果，提示維生素D在CHB患者的抗病毒治療可能發(fā)揮重要作用[9]。目前有關(guān)維生素D3合成酶CYP 2R1與CHB患者體內(nèi)HBVDNA水平的關(guān)系及其對(duì)抗病毒治療效果的影響尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討CHB患者血清CYP2R1含量與恩替卡韋治療后的抗病毒效果之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年9月-2017年9月就診于我院的CHB患者100例，其中男55例，女45例，年齡 21-52歲，平均（40.6±2.6）歲。所選患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)2015年制訂的 《乙型肝炎防治指南》中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者乙肝表面抗原 （HBsAg）陽(yáng)性≥6個(gè)月；⑵年齡＞18歲；⑶既往未接受過(guò)抗病毒藥物或者干擾素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴失代償肝硬化（Child-Pugh）評(píng)分>6分；⑵肝癌或者甲胎蛋白（AFP）>50ng/ml；⑶患其他肝臟疾病或細(xì)菌感染；⑷惡性腫瘤或者嚴(yán)重的慢性疾病。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 給予CHB患者恩替卡韋（恩替卡韋片，南京正大天晴）常規(guī)治療，每次0.5 mg，每天1次，治療12個(gè)月后停用，在治療前及治療期間的第6個(gè)月和第12個(gè)月時(shí)收集患者靜脈血5ml，分離血清后及時(shí)檢測(cè)HBV DNA含量及肝功能生化指標(biāo)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 乙肝病毒學(xué)指標(biāo)乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(HBeAb)、乙肝核心抗體(HBcAb)采用免疫發(fā)光法檢測(cè)，所用儀器及試劑盒均購(gòu)自羅氏公司，儀器為羅氏CobasE411；試劑盒為HBsAg定性試劑盒 （批號(hào)：168216-04）、HBeAg定量試劑盒（批號(hào)：169476-01），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。血清CYP2R1含量采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司（JL20581-96T），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。肝功能指標(biāo)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，IFCC速率法）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，IFCC速率法）、總膽紅素（TBiL，重氮鹽法，STB070）等采用生化儀貝克曼庫(kù)爾特AU5800生化儀檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司。

1.2.3 血清HBVDNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)患者血清中HBV DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。檢測(cè)試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因 （PCR-熒光探針?lè)ǎ〩BV DNA試劑盒（貨號(hào)DA0031）最低檢測(cè)限值為500 IU/ml，分離血清后將200μl血清樣本與450μl DNA提取液混合,置于100℃溫育器中預(yù)熱10min。反應(yīng)總體積 20μl，SYBR Green Master 10μl,上下游引物各 2μl，血清 DNA 模板 2μl，RNase-free H2O補(bǔ)足至20μl，將定量所需試劑加入后，輕彈混勻后離心，按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行：95℃預(yù)變性5min；95℃變性 15s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s,共 35 個(gè)循環(huán)，最后維持4℃。引物序列達(dá)安基因試劑盒中提供。設(shè)置陰性對(duì)照、弱陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)多時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同血清CYP2R1含量患者的基線(xiàn)資料比較根據(jù)患者中位血清CYP2R1含量 （26.5 ng/L），把CYP2R1>26.5 ng/L分為CYP2R1高濃度組 (50例)和 CYP2R1<26.5 ng/L為低濃度組（50例）。CYP2R1高濃度組患者 25（OH）D3水平高于CYP2R1 低濃度組（P＜0.05），兩組患者性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、Child-Pugh評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 2組患者基線(xiàn)資料比較

2.2 不同濃度CYP2R1的CHB患者治療后肝功能的變化 2組患者治療前、治療6個(gè)月、治療12個(gè)月AST、ALT和TBiL水平依次降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各時(shí)間點(diǎn)2組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 恩替卡韋治療前后2組CHB患者肝功能指標(biāo)比較

2.3 不同濃度CYP2R1的CHB患者抗病毒治療后HBV DNA含量改變 2組患者治療前、治療6個(gè)月、治療12個(gè)月病毒載量HBV DNA依次降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；治療前，2組病毒載量HBV DNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)，CYP2R1高濃度組均低于 CYP2R1 低濃度組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 2組患者治療后病毒載量HBV DNA的變化

3 討論

在HBV通過(guò)體液入侵機(jī)體后，造成肝臟組織慢性炎癥感染的過(guò)程中，病毒因素、環(huán)境因素及宿主本身因素均在此過(guò)程中起重要作用[10]。大量的臨床試驗(yàn)和臨床薈萃分析均顯示，患者維生素D缺乏與CHB感染病情發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[11]，維生素D合成障礙或維生素D缺乏均是促進(jìn)CHB慢性病理炎癥發(fā)生的因素之一[12]。有研究報(bào)道，體內(nèi)維生素D缺乏的CHB患者，通常都伴隨著高乙肝病毒載量（HBV DNA含量高），而且維生素D含量高的患者治療結(jié)局會(huì)優(yōu)于水平較低者[13]。研究還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素D與抗病毒治療手段聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可顯著提高機(jī)體的免疫應(yīng)答率，提示維生素D可用于抗病毒治療[14]。機(jī)體25（OH）D3的含量與其代謝酶的關(guān)系密切[15]。25（OH）D3由維生素D3前體在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)25-羥化作用合成，主要由CYP2R1酶催化。CHB患者25（OH）D3降低不僅與維生素D3的合成原料不足[16]，也與肝細(xì)胞合成維生素D相關(guān)代謝酶的活性下降、表達(dá)減少、線(xiàn)粒體損傷有關(guān)[17]。目前的報(bào)道都是僅針對(duì)患者血清維生素D3的含量與HBV在體內(nèi)復(fù)制致病的相關(guān)性及其對(duì)抗病毒治療的作用。而對(duì)于機(jī)體本身維生素D的合成和代謝在CHB發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，2組患者治療前、治療6個(gè)月、治療12個(gè)月病毒載量HBV DNA依次降低，且治療6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)，CYP2R1高濃度組均低于CYP2R1低濃度組,提示CHB患者血清CYP2R1濃度可能與患者病毒DNA復(fù)制情況呈負(fù)相關(guān)，與Zhao等[18]研究結(jié)果一致。但是血清CYP2R1含量對(duì)CHB患者治療后肝功能指標(biāo)AST、ALT和TBiL并沒(méi)有差異，提示血清CYP2R1含量是影響CHB患者HBV DNA的因素之一，其機(jī)制可能是通過(guò)影響維生素D的合成，進(jìn)而影響患者體內(nèi)的乙肝病毒復(fù)制，而不影響宿主的本身肝功能水平。和本研究的結(jié)果一致，有相關(guān)的研究表明乙肝患者的CYP2R1的水平與患者肝功能AST、ALT和 TBiL等指標(biāo)沒(méi)有關(guān)聯(lián)，但是和患者的HBV DNA水平由呈負(fù)相關(guān)，具體的作用機(jī)制并不清楚[19]。

最近大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，血清CYP2R1含量與基線(xiàn)25（OH）D3水平相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，使用恩替卡韋抗病毒治療12個(gè)月后，CYP2R1高濃度組HBsAg、HBeAg陽(yáng)性率均低于CYP2R1低濃度組，CYP2R1高濃度組患者能更好地獲得病毒學(xué)應(yīng)答，提示血清CYP2R1水平可能與CHB的發(fā)病機(jī)制以及抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答有關(guān)，而且是通過(guò)影響維生素D3合成而產(chǎn)生的作用。有研究顯示，在HBV感染初期，HBV攜帶者體內(nèi)25（OH）D3的含量與健康人相比無(wú)明顯變化，但是其羥化酶CYP2R1含量已出現(xiàn)異常[21]，在此基礎(chǔ)上，隨著肝病進(jìn)展至失代償期肝硬化階段，25（OH）D3含量降至最低[11]。但是是否因HBV感染引起肝細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致羥化酶CYP2R1降低，目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。