黎美仁 ，王麗麗 ，徐曉 ，魏淑飛 ，袁燕平

（1.九江學院附屬醫(yī)院病理科，九江 332000；2.九江市婦幼保健院急診科，九江 332000）

胃癌是目前世界范圍最常見惡性腫瘤之一，每年我國胃癌患者數(shù)量約占全球總數(shù)的一半。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果,目前最值得關(guān)注的問題是如何提高患者的生存期和生活質(zhì)量。當今腫瘤靶向治療發(fā)展飛速，靶點的尋找及靶向藥物的研發(fā)至關(guān)重要。Lgr5作為胃癌干細胞潛在標記物，能否作為新的靶點，讓更多胃癌晚期患者以及難以耐受手術(shù)患者獲益值得深入研究。本研究擬通過制作胃腺癌組織芯片，采用免疫組織化學技術(shù)檢測胃腺癌中Lgr5蛋白與Ki67蛋白的表達情況,分析其表達與各腫瘤臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，為胃腺癌患者的治療及判斷預后提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013-2015年九江學院附屬醫(yī)院120例胃腺癌根治標本。標本類型包括：全胃切除標本及部分胃切除標本，其中男86例，女34例；年齡33-81歲，中位年齡62歲，＞60歲者72例，≤60歲者48例；腫瘤直徑＞5cm 22例，≤5cm 98例；依據(jù)不同Lauren分型，彌漫型46例，腸型74例；44例存在脈管內(nèi)瘤栓，76例不存在；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例，無轉(zhuǎn)移者47例；臨床分期：27例Ⅰ期，41例Ⅱ期，44例Ⅲ期，8例Ⅳ期。每例胃癌病例均選取距腫瘤5cm以上的癌旁胃黏膜作為對照組織，所有病例病理切片均由兩位高年資病理醫(yī)師進行重新復核。

1.2 試劑 濃縮型兔抗人Lgr5抗體 （工作濃度1：200，上海碧云天公司）；即用型兔抗人Ki67抗體、MaxVision試劑盒以及DAB顯色試劑購自福州邁新公司。

1.3 方法 所有標本均由4%中性緩沖甲醛溶液固定，再經(jīng)石蠟包埋，4μm切片，過二甲苯、梯度酒精溶液中脫蠟水洗，制成HE切片。組織芯片的制作:復核所有實驗組及對照組的HE切片,選取代表性區(qū)域并在蠟塊上做好標記,選用內(nèi)徑0.8 cm的空心管在蠟塊標記處鉆取組織,然后在空白蠟塊上鉆好直徑0.8 cm的孔,將鉆取的組織芯依次編號并插入相應(yīng)空白蠟塊的孔中，再將蠟塊高溫融化、低溫冷卻，4μm連續(xù)切片，制成微陣列的組織芯片。免疫組織化學染色，采用MaxVision法，選用PBS溶液替代一抗作陰性對照，陽性對照選用存檔陽性片，按照試劑公司所提供的說明書進行實驗操作。

1.4 結(jié)果判定 Lgr5蛋白結(jié)果判定標準：陽性信號定位于胞質(zhì)，對病理切片免疫組化的染色強度進行半定量評分：無陽性信號為0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分；再通過估算陽性細胞所占百分比進行評分：陽性細胞數(shù)小于5%為0分，1分（5%-25%），2 分（26%-50%），3 分（51%-75%），4分（＞76%）；最終評分=染色強度得分×陽性細胞占比得分。染色結(jié)果通過最終評分進行定義：陰性（0 分），弱陽性（＜6 分），強陽性（≥6 分）。 Ki67 蛋白的結(jié)果判讀標準：以細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性信號。每張切片先在低倍視野下，選取組織結(jié)構(gòu)完整、背景清晰的、陽性細胞最為密集的5個區(qū)域，在此區(qū)域中隨機選定5個高倍視野，分別計數(shù)100個細胞，計數(shù)500個細胞中陽性細胞的所占比例，0-25%為 1+，25%-50%為 2+，50%-75%為3+，≥ 75%為4+。為方便統(tǒng)計分析，將 “1+”、“2+”及“3+”合稱為“非強陽性”，將“4+”定義為“強陽性”。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.9軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，Lgr5與Ki67在各組間樣本率的比較采用卡方檢驗，檢驗Lgr5與Ki67在胃腺癌組織表達之間的相關(guān)性則選用Spearman等級相關(guān)分析，當P<0.05時，認定具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Lgr5蛋白和Ki67在胃腺癌及癌旁組織中的表達 120例胃腺癌患者中，Lgr5陽性率30.8%（37/120），其中弱陽性 12例（圖 1），強陽性 25例（圖2），癌旁組織中 Lgr5 表達率 2.5%（3/120），僅 3 例弱陽性，其余117例均為陰性（圖3），比較兩者間差異，差異存在顯著統(tǒng)計學意義 （χ2=34.680，P=0.000）；Ki67 強陽性率 33.3%（40/120）， 其中非強陽性 80例（圖 4），強陽性 40例（圖 5），癌旁組織中Ki67表達均為非強陽性（圖6），強陽性率為0%（0/120），比較兩者間差異，P 值＜0.01（χ2=48.000，P=0.000），差異存在顯著統(tǒng)計學意義。

圖1 胃腺癌中Lgr5蛋白弱陽性表達（MaxVision×200）

圖2 胃腺癌中Lgr5蛋白強陽性表達（MaxVision×200）

圖3 胃腺癌癌旁組織中Lgr5蛋白陰性（MaxVision×200）

圖4 胃腺癌中Ki67蛋白非強陽性表達（MaxVision×200）

圖5 胃腺癌中Ki67蛋白強陽性表達（MaxVision×200）

圖6 胃腺癌癌旁組織中Ki67蛋白非強陽性表達（MaxVision×200）

2.2 Lgr5和Ki67表達與胃腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 比較所有胃腺癌患者Lgr5蛋白的表達，在有無脈管瘤栓、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同臨床分期時，P值均＜0.05，差異存在統(tǒng)計學意義。同時比較Ki67在不同性別、年齡及腫瘤大小之間的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而在不同 Lauren分型、有無脈管瘤栓、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同臨床分期時，P值均＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。（見表1）

表1 Lgr5和Ki67表達與胃腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3 相關(guān)性分析 在 120例胃腺癌組織中，Lgr5及Ki67同時陽性者19例，兩者同時陰性62者例，Lgr5陽性同時Ki67陰性者18例，Lgr5陰性同時Ki67陽性者21例，經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析結(jié)果提示，胃腺癌中Lgr5與Ki67表達存在正相關(guān)（r=0.255,P=0.005 ＜0.05）。 （見表2）

表2 Lgr5及Ki67在胃腺癌中表達的相關(guān)性（例）

3 討論

胃癌是目前世界最常見的惡性腫瘤之一，直接影響了人們的生命健康。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率及致死率分列前三及前五[1]。在不同的胃癌組織類型中，腺癌占比高達95%。相對于發(fā)達國家,亞洲的發(fā)展中國家有著很高的發(fā)病率,特別是在中國，胃癌的每年發(fā)病及死亡人數(shù)都在逐年遞增，2015年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，兩者達到了67.9萬例及49.8萬例[2]。 多數(shù)胃腺癌患者在接受腫瘤治療時,基本均已處于癌癥進展期乃至終末期,預后很差。即使歐美發(fā)達國家，患者的5年生存率仍很低,僅接近15%[3]。 提高胃癌預后的方法除早期發(fā)現(xiàn)外,最重要是制定出個性化的治療方案。

目前研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)惡性腫瘤源于腫瘤干細胞（canser stem cell，CSC）驅(qū)動形成。 CSC 細胞學說認為，人類腫瘤組織中存在極少量的CSC，這些細胞具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能，從而可以促使腫瘤的形成和進展。CSC在增殖過程中，分裂不對稱，除形成一個新的CSC外，還有一個細胞分化成為腫瘤細胞的子細胞；這樣，一方面產(chǎn)生了腫瘤，同時干細胞的數(shù)量也沒有減少[4]。美國癌癥研究協(xié)會將CSC定義為一種具有自我更新能力且能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤的細胞。CSC具有無限增殖潛能，決定了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，同時也是很多腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和難以根治的關(guān)鍵原因。 目前已從多種腫瘤中成功分離和提取出CSC，例如非小細胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤及黑色素瘤等，其都具有相對特異的標記物，如 CD34、ABCG2、BMI-1 等。

Lgr5(leucine-rich repeat containing g-protein coupled receptor 5)可能是胃腸道干細胞的標志之一，基因位于 12q15，大小為 4208bp，內(nèi)含 907個氨基酸開放閱讀框架，表達產(chǎn)物為一種7次跨膜蛋白，隸屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族成員。Lgr5的配體為R-spondin,兩者結(jié)合能增強Wnt/β-catenin信號,并對促進干細胞生長起多效作用[5]。有報道稱Lgr5蛋白陽性腫瘤細胞能促使腫瘤的發(fā)生，而已分化的、短期存在的Lgr5蛋白陰性細胞則喪失了上述功能[6]。Barker等人研究證實小鼠胃中Lgr5陽性細胞分布隨著年齡變化而改變，新生小鼠Lgr5多表達于幽門基底部及腺體集中區(qū)，而成年小鼠則僅僅局限于成熟幽門腺體基底部，這里也是胃癌的常見發(fā)生部位之一[7]。Lgr5目前被認為是胃癌CSC的標志物之一[8]，同時也是食道腺癌、大腸癌、胰腺癌及乳腺癌CSC的有效抗體[9-12]。Yamanoi等[13]應(yīng)用RT-PCR證實癌組織Lgr5-mRNA表達水平遠高于對應(yīng)的正常黏膜組織，且與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。Bu等[14]通過研究257例胃癌病例發(fā)現(xiàn)，Lgr5+患者的預后明顯差于Lgr5-患者，且Lgr5表達與腫瘤組織分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。本組120例胃腺癌同多數(shù)研究結(jié)果一致，LGR5蛋白陽性率30.8%，LGR5陽性胃癌患者臨床分期較高，且更易出現(xiàn)脈管瘤栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

Ki67是一種細胞增殖核抗原蛋白，與細胞有絲分裂的過程有著密切的聯(lián)系，其指數(shù)高低能反映細胞正常增殖活動，提示腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是判別細胞群增殖比率的最佳標志物之一[15，16]。Ki67在絕大多數(shù)腫瘤中表達，特別是惡性腫瘤，與腫瘤的進展、浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)[17-19]。Min等[20]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Ki67表達與腫瘤進展、組織學分級、淋巴轉(zhuǎn)移、腹膜浸潤及復發(fā)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，胃腺癌中Ki67的表達與脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)，同時彌漫型胃腺癌較腸型更易出現(xiàn)Ki67強表達。

綜上所述，腫瘤干細胞標記物Lgr5+及增殖指數(shù)Ki67強陽性的胃腺癌，臨床分期高，易于出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管瘤栓，均與臨床預后密切相關(guān)，而二者表達與患者年齡、性別及腫瘤大小無明顯關(guān)聯(lián)；通過分析本組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃腺癌中Lgr5與Ki67的表達呈正相關(guān)，提示兩者在胃腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在協(xié)同作用。