周俏苗 陳秋霞 黃海燕 許晶 肖美芳 龔護(hù)民 吳棟才

1海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科（?？?70000）；2海南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（?？?70000）

子癇前期（pre-eclampsia，PE）為妊娠期高血壓的一 種［1］。研究證實(shí)微小RNA（microRNA，miRNA）、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管生成失衡以及信號(hào)通路等均在PE 的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［2-3］。滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能失調(diào)被認(rèn)為是PE 發(fā)病的重要病理機(jī)制之一［4］。近年來(lái)AT富集序列特異性結(jié)合蛋白1（special AT-rich sequence-binding protein 1，SATB1）與PE 滋養(yǎng)層細(xì)胞的關(guān)聯(lián)越來(lái)越受到關(guān)注。SATB1 基因敲除顯著降低了β-catenin 水平，降低了滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲能力［5］。此外，缺氧可抑制子癇前期發(fā)病過(guò)程中SATB1 和β-catenin 的表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲［6］。CHOI 等［7］在對(duì)子癇前期的miRNA 表達(dá)譜進(jìn)行分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常胎盤組織，miR-191 在重度子癇前期胎盤組織中表達(dá)增強(qiáng)。但是對(duì)于miR-191 具體如何參與PE 的進(jìn)展尚沒(méi)有相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)miR-191-5p 與SATB1 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)觀察滋養(yǎng)層細(xì)胞的變化探究miR-191-5p 靶向SATB1 參與PE 調(diào)控的潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo 購(gòu)買于美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3、JAR 購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR-8/SVneo 細(xì)胞以5×105/mL的濃度接種于6 孔板中培養(yǎng)，分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。包括mimics NC 組（miRNA mimic 陰性對(duì)照）、mimics miR-191-5p 組（miRNA-191-5p 模擬物轉(zhuǎn)染）、inhibitors NC 組（miRNA 抑制劑陰性對(duì)照）、inhibitors miR-191-5p 組（miR-191-5p 抑制劑），以及pcDNA組（空載質(zhì)粒）、pcDNA+SATB1 組（SATB1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）、si-NC 組（干擾SATB1 表達(dá)陰性對(duì)照）、si-SATB1 組（干擾SATB1 表達(dá)）。使用lipofectamin 2000（Invitrogen）試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)生信網(wǎng)站Target Scan預(yù)測(cè)miR-191-5p 與SATB1 存在結(jié)合位點(diǎn)，再用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-191-5p 與SATB1 的靶向調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)雙熒光素酶試劑盒（Promega）說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因按照說(shuō)明書指示，使用TRIzol 試劑（Life 公司）進(jìn)行總RNA 的提取，Nano-Drop 2000c（Thermo Scientific）對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量。接著按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書指示（TaKaRa，Japan），將1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（Qiagen，美國(guó)）檢測(cè)目的基因的表達(dá)。以GAPDH 作為其他基因內(nèi)參照，以U6 為miRNA-191-5p 的內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 表達(dá)，所有引物均來(lái)自上海生工公司。

1.4 WB 檢測(cè)目的蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用RIPA裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，BCA 試劑盒（Thermo Fisher，美國(guó)）檢測(cè)蛋白濃度。行SDS-凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上（Millipore，美國(guó)）。5% BSA 封閉后加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST 洗滌3 次，每次15 min。然后加入稀釋好的羊抗兔二抗室溫孵育90 min，PBST 洗滌3次，每次15 min。ECL 顯影。暗室曝光，Image J軟件分析蛋白表達(dá)?？贵w均購(gòu)自Proteintech公司。

1.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板，每組6 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，棄掉培養(yǎng)，加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基，接著加入10 μL（5 mg/mL）/孔的MTT 溶液（購(gòu)買于上海碧云天生物），再將96 孔板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 處吸光度。

1.6 EdU 檢測(cè)細(xì)胞增殖各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（4×103細(xì)胞/孔）接種于96 孔板，按照EdU 檢測(cè)試劑盒（銳博，廣州）說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.7 Transwell 檢測(cè)遷移轉(zhuǎn)染48 h 后，各組細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓處理24 h，PBS 沖洗2 次。將7 000 μL 含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基加入下室；上室加入含1% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸好的細(xì)胞懸液約200 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell 小室，棉簽擦去上室內(nèi)面的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS 洗3 遍，用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行拍照，穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均基于至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間比較為t檢驗(yàn)，多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析（SPSS 21.0，Inc，Chicago，IL，USA）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-191-5p 及SATB1 在人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo 及人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3、JAR 中的表達(dá)同JEG-3、JAR 相比，miR-191-5p在HTR-8/Svneo 細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，SATB1 表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）。故人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/Svneo 被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1）。

2.2 miR-191-5p 靶向負(fù)調(diào)控SATB1生信網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)miR-191-5p 與SATB1 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。接著雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與mimics NC 組相比，mimics miR-191-5p 與野生型SATB1-WT 共轉(zhuǎn)染組中熒光素酶活性強(qiáng)度下降（P＜0.05，t=1.563，圖2B）。同mimics NC 相比，mimics miR-191-5p 組SATB1 低表達(dá)（P＜0.05，t=2.67）。以上結(jié)果說(shuō)明miR-191-5p 可以靶向調(diào)控SATB1 基因表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖2。

圖1 miR-191-5p 及SATB1 在滋養(yǎng)層來(lái)源的細(xì)胞系的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-191-5p and SATB1 in trophoblast derived cell lines

圖2 miR-191-5p 與SATB1 的靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.2 Target relationship verification between miR-191-5p and SATB1

2.3 過(guò)表達(dá)/抑制miR-191-5p 表達(dá)可抑制/促進(jìn)HTR-8/SVneo 細(xì)胞增殖及遷移同mimics NC 組相比，mimics miR-191-5p 組增殖能力下降28%（P＜0.05，t=2.18），同時(shí)，遷移能力降低（P＜0.05，t=1.42）；mimics miR-191-5p 組在基因和蛋白水平MMP-2（P＜0.05，t=1.82；P＜0.05，t=1.81）及MMP-9（P＜0.05，t=1.11；P＜0.05，t=5.72）均表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)/抑制miR-191-5p 后HTR-8/SVneo 細(xì)胞增殖及遷移結(jié)果Fig.3 Cell proliferation and migration results of HTR-8/Svneo after overexpression or inhibition of miR-191-5p

2.4 過(guò)表達(dá)/抑制miR-191-5p 表達(dá)可抑制/促進(jìn)HTR-8/SVneo 細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化同mimics NC 相比，mimics miR-191-5p 組Vimentin（P＜0.05，t=2.58）、N-cadherin（P＜0.05，t=2.61）在蛋白水平均表達(dá)下調(diào)，E-cadherin（P＜0.05，t=11.58）表達(dá)上調(diào)。見(jiàn)圖4。

2.5 過(guò)表達(dá)/干擾SATB1 后會(huì)抑制/促進(jìn)HTR-8/SVneo 細(xì)胞系增殖及遷移同pcDNA 相比，pcDNA+SATB1 組細(xì)胞EdU 陽(yáng)性細(xì)胞增加24%（P＜0.05，t=1.37），同時(shí)遷移能力增加（P＜0.05，t=3.08）；pcDNA+SATB1組MMP-2（P＜0.05，t=91.42；P＜0.05，t=1.91）、MMP-9（P＜0.05，t=2.03；P＜0.05，t=5.08）在基因和蛋白水平均表達(dá)上調(diào)。見(jiàn)圖5。

2.6 過(guò)表達(dá)/干擾SATB1 后會(huì)抑制/促進(jìn)HTR-8/SVneo 細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化同pcDNA 相比，pcDNA+SATB1 組Vimentin（P＜0.05，t=4.61）、N-cadherin（P＜0.05，t=1.42）在蛋白水平均表達(dá)上調(diào)，E-cadherin（P＜0.05，t=3.08）表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖6。

3 討論

圖4 過(guò)表達(dá)/抑制miR-191-5p 后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of Epithelial stromal transformation related proteins after overexpression or inhibition of miR-191-5p

圖5 過(guò)表達(dá)/干擾SATB1 后HTR-8/SVneo 細(xì)胞增殖及遷移結(jié)果Fig.5 Cell proliferation and migration results of HTR-8/Svneo after overexpression or silencing of SATB1

有研究在探討子宮內(nèi)膜異位癥這一婦科疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-191 在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)高于正常人，且miR-191 能夠通過(guò)對(duì)TIMP3 進(jìn)行調(diào)節(jié)從而影響細(xì)胞的增殖和侵襲［8］。另外也有研究［7］發(fā)現(xiàn)，miR-191 的表達(dá)在PE 胎盤中增強(qiáng)，推測(cè)miR-191 的異常表達(dá)與PE 的進(jìn)展有關(guān)。本研究通過(guò)探討miR-191-5p 調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)而參與PE 進(jìn)展的角度對(duì)miR-191-5p 的作用進(jìn)行了探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-191-5p 能夠抑制HTR-8/Svneo 細(xì)胞的增殖和遷移。MMP-2 和MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，其能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，在組織重構(gòu)、細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成等多方面發(fā)揮重要作用［9］。此外，WANG 等［10］證實(shí)，EG-VEGF 能夠激活ERK 信號(hào)通路，上調(diào)MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)進(jìn)而增進(jìn)滋養(yǎng)層HTR-8/Svneo 細(xì)胞侵襲。通過(guò)上調(diào)HTR-8/Svneo 細(xì)胞中的miR-191-5p 結(jié)果表明，HTR-8/Svneo 細(xì)胞的增殖活力、侵襲被抑制，MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)也降低。進(jìn)一步表明了miR-191-5p 在影響MMP 家族因子表達(dá)以及滋養(yǎng)層細(xì)胞中的作用，提示以miR-191-5p 作為靶點(diǎn)對(duì)PE 進(jìn)行干預(yù)的可能。

圖6 過(guò)表達(dá)/干擾SATB1 后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of Epithelial stromal transformation related proteins after overexpression or silencing of SATB1

有文獻(xiàn)［11］表明，SATB1 在人體胎盤中的表達(dá)受氧化應(yīng)激的影響，其可能通過(guò)調(diào)控β-catenin 信號(hào)通路的影響進(jìn)而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移。此外WU 等［6］在研究中證實(shí)了SATB1 在PE 進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-191-5p 與SATB1 之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)其可能通過(guò)相互作用進(jìn)而影響PE。之后通過(guò)干擾HTR-8/Svneo 細(xì)胞中SATB1 的表達(dá)進(jìn)而發(fā)現(xiàn)SATB1 能夠?qū)TR-8/Svneo 細(xì)胞的增殖、侵襲進(jìn)行調(diào)控。EMT 指的是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，該過(guò)程使得轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞喪失黏附功能并且增強(qiáng)侵襲和遷移能力［12］。滋養(yǎng)細(xì)胞分化不良以及螺旋動(dòng)脈重塑異常被認(rèn)為是引起PE 的重要原因［13］。而近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明滋養(yǎng)層細(xì)胞EMT 減弱進(jìn)而使得滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲降低可能是引發(fā)PE 的重要原因。EMT 發(fā)生時(shí)，E-cadherin 表達(dá)降低而N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)增加。本研究干擾HTR-8/Svneo 細(xì)胞中miR-191-5p 和SATB1 表達(dá)后對(duì)EMT相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-191-5p 或抑制SATB1 的表達(dá)能夠抑制HTR-8/Svneo 細(xì)胞EMT的發(fā)生。

綜上所述，miR-191-5p 有望成為PE 治療的重要靶點(diǎn)，本研究也將為PE 相關(guān)靶向藥物的研發(fā)提供一些方向。