劉冰瀅 王文波 黃佳 高振 武曉莉 劉偉

創(chuàng)面愈合是皮膚組織損傷后的正常過程，涉及炎癥、細(xì)胞增殖、基質(zhì)產(chǎn)生、組織重塑和再生等階段[1]。每個(gè)階段的順利進(jìn)行對(duì)于確保創(chuàng)面的正常愈合，以及皮膚修復(fù)和功能恢復(fù)至關(guān)重要[2-3]。

炎癥階段在正常的創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用，因?yàn)檠装Y將巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞募集到創(chuàng)面處，以清除細(xì)胞碎片并產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[4-5]，進(jìn)而促進(jìn)基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，促進(jìn)新生組織填補(bǔ)創(chuàng)面缺損[6]。病理情況下，缺乏適當(dāng)?shù)难装Y細(xì)胞，如糖尿病患者的創(chuàng)面，將導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合。

巨噬細(xì)胞可分為Ⅰ型(M1)和Ⅱ型(M2)，前者對(duì)于創(chuàng)面清創(chuàng)和生長(zhǎng)因子、基質(zhì)的產(chǎn)生起了重要作用，后者則促進(jìn)組織重塑和再生[7-8]。因此，M2表型極化對(duì)促進(jìn)創(chuàng)面愈合和再生具有重要作用[9]。

積雪草酸是一種植物提取物，具有多種功能，例如抗氧化[10]、抗微生物[11]、抗凋亡[12]、抗癌活性[13]等。其在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮雙重功能，即抑制病理性瘢痕中細(xì)胞增殖和膠原蛋白的生成，同時(shí)還可促進(jìn)正常的創(chuàng)面愈合和膠原蛋白生成[14-16]。但是，傳統(tǒng)積雪草酸具有較低的生物利用度，水溶性差。因此，本研究采用水溶性的積雪草酸葡萄糖胺鹽(AAGS)作為新的藥物形式[17]，并探索其對(duì)促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

胎牛血清 FBS(ScienCell，美國(guó))，RPMI1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(Hyclone，美國(guó))，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B(Gibco，美國(guó))，二甲亞砜(上海滬試化工有限公司)，凝膠敷料(清得佳)(Smith & Nephew，美國(guó))，AMV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國(guó))，CD86抗體(ab53004，Abcam，美國(guó))，CD163抗體(GB11340-1，Servicebio，美國(guó))，二抗(GB23303，Servicebio，美國(guó))。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo，美國(guó))，PCR儀(Biometra，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

共14只5周齡雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量150 g(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院SPF實(shí)驗(yàn)室)，并在安靜、通風(fēng)、恒溫的環(huán)境下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度(50%±10%)，12 h光暗交替。獨(dú)籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水，喂食大鼠專用飼料，定時(shí)更換墊料。本研究經(jīng)第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)。

1.3 建立大鼠背部皮膚創(chuàng)面模型及實(shí)驗(yàn)分組

大鼠麻醉后，背部備皮消毒后，用活檢打孔器(直徑0.8 cm)在大鼠背部?jī)蓚?cè)制作兩個(gè)全層皮膚切除創(chuàng)面(每側(cè)脊柱旁1 cm)，采用硅膠圈固定以防創(chuàng)面張開。一側(cè)設(shè)為實(shí)驗(yàn)組(Exp)，一側(cè)設(shè)為對(duì)照組(Ctrl)。實(shí)驗(yàn)組每天外用AAGS凝膠(30 mg/mL溶于PBS)；對(duì)照組每天外用凝膠敷料(清得佳)。分別在第0、3、7、10和14天對(duì)創(chuàng)面行大體觀察并拍照，并分別在第3天(n=4)、第7天(n=4)和第14天(n=6)取材。

1.4 小鼠巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將裝有RAW264.7細(xì)胞的凍存管從液氮中取出，快速?gòu)?fù)蘇。離心后加入RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106個(gè)/孔，種入6孔板中，37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每24小時(shí)換液，分別加入0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL AAGS培養(yǎng)48 h。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1大鼠創(chuàng)面面積的測(cè)定

第0、3、7、10和14天拍攝的創(chuàng)面大體照片使用Image-ProPlus(6.0版，Media Cybernetics，Silver Spring，美國(guó))進(jìn)行創(chuàng)面面積的測(cè)量。

1.5.2表皮厚度和表皮嵴數(shù)的測(cè)定

第3、7和14天取材的創(chuàng)面組織，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜、石蠟包埋、切片(5 μm)，HE染色，測(cè)定表皮厚度和表皮嵴數(shù)量。取第14天的組織切片(每組各6張)，選擇表皮下方中間區(qū)域(40×)，分別從圖像的左側(cè)、中部和右側(cè)三處測(cè)量表皮厚度。此外，將每張圖片(40×)的表皮區(qū)域均勻劃分為5個(gè)區(qū)域，6張組織切片共30個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有表皮嵴則計(jì)數(shù)為1，沒有表皮嵴則計(jì)數(shù)為0，30個(gè)區(qū)域相加得出各組的表皮嵴總數(shù)。

1.5.3炎癥細(xì)胞的半定量分析

取第3天HE染色切片，于每張切片的表皮下方中間及兩側(cè)位置分別選擇一張放大的圖片(400×)，每張圖片手工計(jì)數(shù)藍(lán)色深染的炎性細(xì)胞(單個(gè)核，圓形細(xì)胞)，綜合3張圖片獲得炎性細(xì)胞數(shù)的平均值。同樣方法得到第7天(n=4)和第14天(n=6)各組的炎癥細(xì)胞數(shù)平均值。

1.5.4免疫組織化學(xué)分析

取第14天組織切片(n=6)，采用CD86(1∶200)和CD163(1∶200)抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌2次，二抗(1∶300)室溫孵育30 min，最后用3,30-二氨基聯(lián)苯胺顯色劑染色輔以少量蘇木精襯染，并采用積分光密度(IOD)/面積值來測(cè)定蛋白質(zhì)的表達(dá)量。

1.5.5定量RT-PCR 檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞M1和M2型的表達(dá)

將不同濃度AAGS培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞懸液接種到6孔板上，培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)核算純度，A260/A280比值為1.8～2.0。每個(gè)標(biāo)本以1.5 μg總RNA為模板，按AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制20 μL反應(yīng)體系：5×Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，200 ng/μL Oligo dT-Adaptor Primer 1 μL，40 U/μL RNase抑制劑0.5 μL，5 U/μL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，反應(yīng)體系加水配平至20 μL。反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

cDNA在qPCR儀中擴(kuò)增，反應(yīng)體系：ddH2O 7 μL，MIX 10 μL，cDNA 1 μL，前引物1 μL，后引物1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s、72 ℃ 10 min為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參照(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequence

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AAGS對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的影響

第0、3、7、10和14天大體觀可見實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合相對(duì)較快，定量分析顯示在第10天實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面面積明顯小于對(duì)照組(P<0.05)(圖1A、B)。

組織學(xué)觀察可見，第3天兩組創(chuàng)面均見明顯的組織缺損；第7天實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面新生肉芽組織明顯多于對(duì)照組，上皮化過程明顯加快；第14天兩組創(chuàng)面完全被新生組織填充，并完全上皮化，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面可見表皮嵴結(jié)構(gòu)，但對(duì)照組罕見(圖1C)。

2.2 AAGS對(duì)于大鼠創(chuàng)面表皮重塑和再生的影響

組織學(xué)觀察：對(duì)照組表皮較厚且缺少表皮脊結(jié)構(gòu)，而實(shí)驗(yàn)組表皮較薄，可見明顯表皮脊結(jié)構(gòu)。定量分析：對(duì)照組創(chuàng)面表皮厚度為(76.43±21.63)μm，明顯大于實(shí)驗(yàn)組(57.92±14.96)μm，差異顯著(P<0.05)。半定量分析：實(shí)驗(yàn)組30個(gè)區(qū)域中有27區(qū)域出現(xiàn)表皮脊結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組僅有8個(gè)區(qū)域出現(xiàn)表皮脊結(jié)構(gòu)，差異顯著(P<0.05)(圖2)。

A：大體觀；B：創(chuàng)面面積(*： P<0.05)；C：組織學(xué)觀察(比例尺=500 μm) A: Gross observation; B: Wound area (*: P<0.05); C: Histological observation (scale=500 μm)圖1 各時(shí)間點(diǎn)兩組創(chuàng)面大體觀及組織學(xué)觀察Fig. 1 Gross and histological observation of the two groups at each time point

A：組織學(xué)觀察(比例尺=200 μm)；B：表皮厚度(**： P<0.01)；C：表皮嵴數(shù)(***： P<0.001) A: Histological observation (scale=200 μm); B: Epidermal thickness (**: P<0.01); C: Number of epidermal ridge (***: P<0.001)圖2 兩組表皮厚度和表皮嵴數(shù)的測(cè)定Fig. 2 Measurement of epidermal thickness and epidermal ridge number of the two groups

2.3 AAGS對(duì)創(chuàng)面炎性細(xì)胞的影響

組織學(xué)觀察可見，在第3天和第7天，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面可觀察到更多的炎性細(xì)胞(單個(gè)核、原型細(xì)胞)，但在第14天，兩組炎性細(xì)胞數(shù)量相似。半定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組在第3天的炎癥細(xì)胞數(shù)分別為(171.33±14.81)和(118.83±14.25)(P<0.05)，第7天分別為(83.42±13.78)和(57.69±13.42)(P<0.05)，第14天分別為(60.08±15.48)和(53.25±9.35)(P>0.05)(圖3)。

A、B、C：組織學(xué)觀察(比例尺=50 μm)；D：炎性細(xì)胞數(shù)量(*： P<0.05) A, B, C: Histological observation (scale=50 μm); D: Number of inflammatory cells (*: P<0.05)圖3 各時(shí)間點(diǎn)兩組炎癥細(xì)胞的半定量分析Fig. 3 Semi-quantitative analysis of inflammatory cells of the two groups at various time points

2.4 AAGS在體內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面中的M1細(xì)胞(CD68陽性細(xì)胞)比對(duì)照組略多，而實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面中的M2細(xì)胞明顯多于對(duì)照組。半定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面中的M1和M2細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。

A、B：組織學(xué)觀察(比例尺=50 μm)；C：CD86 IOD值(*： P<0.05)；D：CD163 IOD值(***： P<0.001) A, B: Histological observation (scale=50 μm); C: CD86 IOD value (*: P<0.05); D: CD163 IOD value (***: P<0.001)圖4 兩組免疫組織化學(xué)分析結(jié)果Fig. 4 Immunohistochemical analysis of the two groups

2.5 AAGS在體外對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向的影響

小鼠巨噬細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高劑量藥物處理后，M1標(biāo)記物IL-1、IL-6和INOS的基因表達(dá)相對(duì)增強(qiáng)。但是，M2標(biāo)記基因(CD206和KLF4)的表達(dá)呈現(xiàn)出劑量依賴性誘導(dǎo)效應(yīng)(P<0.05)，驗(yàn)證了AAGS可以誘導(dǎo)M2極化(圖5)。

A：M1型分化相關(guān)mRNA的表達(dá)；B：M2型分化相關(guān)mRNA的表達(dá) A: M1-type differentiation-related mRNA expression; B: M2-type differentiation-related mRNA expression 圖5 AAGS對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響(*： P<0.05；**： P<0.01；***： P<0.001)Fig. 5 Effect of AAGS on mouse macrophage-related mRNA expression (*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001)

3 討論

創(chuàng)面愈合是治愈皮膚損傷的正常過程，由內(nèi)源性因素完成該過程，如巨噬細(xì)胞[17]、生長(zhǎng)因子[18]和細(xì)胞因子[19-20]等。特別是當(dāng)創(chuàng)面內(nèi)伴隨大塊組織缺損時(shí)，快速肉芽組織形成和隨后的上皮形成是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵步驟[21-22]。

新生毛細(xì)血管的生成和炎癥細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子是誘導(dǎo)創(chuàng)面愈合過程的關(guān)鍵因素，依賴已形成的血塊內(nèi)的血小板和創(chuàng)面炎癥細(xì)胞釋放生物活性因子，以促進(jìn)創(chuàng)面愈合[23]。然而，在難愈性、慢性創(chuàng)面(如糖尿病或老年人)愈合中，經(jīng)?？捎^察到這些創(chuàng)面缺乏適當(dāng)?shù)难装Y過程和血管生成[24-25]，此時(shí)需要藥物和其他手段的干預(yù)[26]。

積雪草酸是一種植物提取物，可通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白在體外[27]或體內(nèi)的生成[28-30]來促進(jìn)創(chuàng)面愈合。傳統(tǒng)的積雪草酸具有較低的水溶性， AAGS(積雪草酸葡糖胺鹽)則具有較高的水溶性[17]。更重要的是，AAGS在PBS中經(jīng)過超聲震蕩處理后，以高于30 mg/mL的濃度自發(fā)形成水凝膠，成為創(chuàng)面局部治療的理想形式[17]。

大體和組織學(xué)觀察顯示，AAGS處理后創(chuàng)面總體愈合加快。其可能的機(jī)制是藥物誘導(dǎo)了早期的炎癥反應(yīng)，以增加炎癥因子和生長(zhǎng)因子的分泌[31]。半定量分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組早期(第3天和第7天)的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組。

此外，AAGS可加速愈合組織的重塑和再生。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面上皮成熟更快(第7天)，且較對(duì)照組表皮更薄，差異顯著(P<0.05)。表皮增厚被認(rèn)為是一種病理性改變，通?？捎诋惓ｑ：?如瘢痕疙瘩)中觀察到[32]。AAGS處理可使得愈合創(chuàng)面表皮變薄，表明AAGS可重塑表皮結(jié)構(gòu)。更為重要的是，經(jīng)AAGS處理的創(chuàng)面中出現(xiàn)了表皮脊結(jié)構(gòu)(皮膚發(fā)育過程中成熟表皮的特征[33])，而對(duì)照組罕見(該現(xiàn)象通常在異常瘢痕形成中缺乏[34])，兩組存在顯著差異(P<0.05)。這一結(jié)果表明，AAGS可能有助于再生表皮結(jié)構(gòu)，從而更好地恢復(fù)表皮功能。

巨噬細(xì)胞一項(xiàng)很重要的功能是誘導(dǎo)炎癥和組織再生，前者由M1型巨噬細(xì)胞執(zhí)行，而后者由M2型巨噬細(xì)胞執(zhí)行[35]。本研究結(jié)果顯示，第14天的創(chuàng)面組織中，實(shí)驗(yàn)組的M2細(xì)胞明顯多于對(duì)照組。相比之下，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面中僅發(fā)現(xiàn)了少量的M1細(xì)胞增加。這些結(jié)果提示，AAGS可能在創(chuàng)面早期誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞形成，通過促進(jìn)炎癥因子和生長(zhǎng)因子的分泌而促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、增殖和基質(zhì)分泌，從而形成新生肉芽組織填充創(chuàng)面，然后巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為主要的M2表型，從而促進(jìn)皮膚再生。這一假設(shè)也得到體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。

AAGS由于采用了積雪草酸與氨基葡萄糖之間的化學(xué)鍵合，大大提高了生物利用度，提高了水溶性，達(dá)到一定濃度(>30 mg/mL)后可制成水凝膠，便于臨床局部治療的使用。本研究為積雪草酸葡糖胺鹽的臨床應(yīng)用提供了良好的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。