陳胤賢 蔣健一 趙宇 孫軍

感染、創(chuàng)傷、腫瘤等造成的大范圍骨缺損是臨床的一大難題。常見的修復(fù)方法，如自體骨移植、異體骨移植、人工材料等，存在創(chuàng)傷大、供體骨有限、費用高等缺點，組織工程技術(shù)為解決這一難題提供了新的可能。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF2)因可在體外促進BMSCs增殖及成骨分化，被廣泛應(yīng)用于骨缺損研究[1-2]。但是，骨缺損的修復(fù)用時較長，局部加入FGF2易被代謝，無法長時間維持生物活性。因此，基因治療被用于骨缺損修復(fù)，而合適的基因載體尤為重要[3-4]。我們的前期工作證實，殼聚糖具有極好的生物相容性和低細(xì)胞毒性，且經(jīng)過改性后制成巰基烷基化殼聚糖(Thiolated N-alkylated chitosan，TACS)和羥丁基殼聚糖(Hydroxylbutyl chitosan，HBC)，可先后通過正負(fù)電荷作用包裹基因，形成以TACS為核、HBC為殼的納米粒子，該粒子可在體內(nèi)緩慢降解，釋放目的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達蛋白，從而發(fā)揮生物活性[5]。

本研究旨在探究改性殼聚糖攜載FGF2基因在體內(nèi)促進兔橈骨臨界骨缺損愈合過程中的作用，以期為臨床骨缺損的修復(fù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

實驗動物：共使用15只3月齡新西蘭兔(安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)，體質(zhì)量約3.0 Kg，雌雄不限。

實驗材料：兔BMSCs(賽業(yè)生物科技有限公司)； HBC和TACS(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料與化學(xué)研究實驗室饋贈)；pFGF2基因過表達載體(上海吉凱基因科技有限公司)；質(zhì)粒大量提取試劑盒(天根生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；CCK8試劑(日本同仁公司)；PCR試劑盒、引物(上海銳博生物科技有限公司)；兔抗兔FGF2抗體、HRP標(biāo)志的山羊抗兔IgG(美國Sigma公司)。

1.2 HBC@TACS-pFGF2基因載體微球的制備

體外擴增培養(yǎng)基因過表達菌株，用質(zhì)粒大量提取試劑盒收集菌體提取質(zhì)粒，Nano Drop2000測定質(zhì)粒濃度，標(biāo)記濃度后置于-20 ℃保存。參照前期研究方法，殼聚糖與質(zhì)粒的氮磷比為20∶1(氮元素代表殼聚糖的相對分子質(zhì)量，磷元素代表質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量)，在無菌條件下將TACS與pFGF2質(zhì)粒于PBS緩沖液中混勻、渦旋震蕩30 s后室溫靜置30 min形成TACS-pFGF2，然后再向溶液中加入與TACS等量的HBC，渦旋震蕩30 s，混勻后室溫靜置30 min，制備成HBC@TACS-pFGF2基因載體微球，置于-20 ℃?zhèn)溆肹5]。

1.3 HBC@TACS-pFGF2與BMSCs共培養(yǎng)

1.3.1體外轉(zhuǎn)染BMSCs

將BMSCs按5 000個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后加入質(zhì)粒含量為5 μg的HBC@TACS-pFGF2基因載體微球，繼續(xù)培養(yǎng)1、3、7 d后棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍后加入RIPA裂解液，冰上30 min裂解細(xì)胞，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，吸去上清液，提取蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，每孔上樣量30 μg。轉(zhuǎn)膜后FGF2抗體以1∶1 000進行稀釋，孵育過夜，二抗以1∶5 000進行稀釋。ECL法曝光獲得圖像。Image J軟件分析條帶灰度，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的比值判斷蛋白表達的相對含量。

1.3.2細(xì)胞活力檢測

用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)兔BMSCs，待細(xì)胞融合至80%～90%時進行消化傳代，取第3～6代細(xì)胞用于實驗。

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行消化，離心，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目，按2 000個/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，向孔板中加入含有不同濃度pFGF2質(zhì)粒(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL)的HBC@TACS-pFGF2基因載體微球。不加HBC@TACS-pFGF2基因載體微球的孔板設(shè)為對照。將細(xì)胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基和10 μL的CCK8溶液，37 ℃孵育4 h，測量450 nm處吸光度(OD值)，計算細(xì)胞增殖率。

1.3.3RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因和成血管相關(guān)基因的表達

將BMSCs按照5 000個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后加入含HBC@TACS-pFGF2基因載體微球的DMEM，其中pFGF2質(zhì)粒濃度為100 μg/mL。分別培養(yǎng)3 d、7 d后棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍TRIzol裂解細(xì)胞，提取RNA。用PrimeScript RT Enzyme Mix I將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用熒光SYBR Green QPCR Master Mix(TakaRa)進行PCR(表1)。應(yīng)用Applied Biosystem7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System 進行實驗。PCR反應(yīng)預(yù)變性溫度：95 ℃，30 s，1個循環(huán)。循環(huán)反應(yīng)溫度：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，40個循環(huán)。擴增結(jié)果用 QuantStudio Real-Time PCR Software進行分析。

表1 實時定量RT-PCT引物Table 1 Quantitative realtime RT-PCR primer sets

1.4 兔橈骨骨缺損修復(fù)實驗

無菌條件下將明膠海綿切割成18 mm×20 mm大小[6]，將pFGF2質(zhì)粒濃度為100 μg/mL的HBC@TACS-pFGF2緩慢滴加到明膠海綿中。無菌條件下將明膠海綿凍干，防止手術(shù)過程中因擠壓造成基因載體丟失。將明膠海綿壓縮,卷成18 mm長的柱狀備用。

新西蘭兔麻醉后仰臥位，無菌條件下切開皮膚，暴露橈骨，去除中段包括骨膜在內(nèi)的長18 mm的橈骨，制備雙側(cè)橈骨臨界骨缺損模型，左側(cè)植入明膠海綿和HBC@TACS-pFGF2微球(實驗組，n=15)，右側(cè)不作植入(對照組，n=15)。縫合后消毒包扎，并用3 M軟石膏將兔前肢固定。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，術(shù)后3 d皮下注射青霉素防止術(shù)后感染。移植術(shù)后第4周、8周、12周分別取材，行X線檢查、大體觀察，骨標(biāo)本經(jīng)10%EDTA脫鈣后切片，行Masson染色，觀察新生骨組織的礦化情況。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 Western-blot檢測FGF2蛋白表達情況

HBC@TACSpFGF2基因載體微球與BMSCs體外共培養(yǎng)后可成功表達FGF2蛋白，且隨時間增長FGF2蛋白的表達水平有增高趨勢(圖1)。

圖1 共培養(yǎng)第1、3、7天后western-blot檢測FGF2蛋白表達情況Fig. 1 The expression of FGF2 protein detected by western-blot after 1, 3 and 7 days of co-culture

2.2 細(xì)胞活力檢測

與對照組相比(對照組細(xì)胞活性以100%表示)，不同TACS@HBC-pFGF2濃度條件下，BMSCs的相對增殖率分別為111.6%±7.59%、136.9%±3.127%、154.2%±5.34%、84.9%±3.20%、14.1%±1.96%。隨著pFGF2質(zhì)粒濃度的提高，BMSCs的增殖率逐漸增高，當(dāng)pFGF2質(zhì)粒濃度達到100 μg/mL時細(xì)胞增殖率最高，當(dāng)pFGF2質(zhì)粒濃度為200 μg/mL、300 μg/mL時細(xì)胞增殖率驟降。說明體外培養(yǎng)時適當(dāng)添加pFGF2質(zhì)?？纱龠MBMSCs增殖，但是pFGF2質(zhì)粒濃度過高可對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此，后續(xù)實驗選取100 μg/mL作為pFGF2質(zhì)粒的濃度(圖2)。

2.3 ALP mRNA和CD31 mRNA的表達情況

BMSCs在體外與pFGF2質(zhì)粒濃度為100 μg/mL的TACS@HBC-pFGF2共培養(yǎng)后，其成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶ALP mRNA和成血管相關(guān)基因CD31 mRNA的表達量隨時間推移逐漸增高，且在第7天時其表達量與對照組相比具有明顯差異(圖3)。

2.4 大體標(biāo)本觀察

對照組在第4～8周時缺損斷端骨痂形成不明顯，缺損長度仍為18 mm，術(shù)后第8～12周時對照組的骨缺損斷端開始形成較多骨痂，并可見缺損逐漸變小，但是在第12周時骨缺損依舊存在，斷端未連續(xù)。實驗組在第4周時即可觀察到明顯的骨痂形成并伴有纖維組織將斷端連接，在第8周時骨痂已將缺損填充，第12周時骨缺損基本修復(fù)，橈骨連續(xù)性好(圖4)。

圖3 HBC@TACS-pFGF2與BMSCs共培養(yǎng)3 d、7 d后ALP mRNA和CD31 mRNA的表達情況 (*： 與對照組相比，P<0.05；**： 與對照組相比，P<0.01)Fig. 3 The levels of ALP mRNA and CD31 mRNA of BMSCs co-cultured with HBC@TACS-pFGF2 for 3 and 7 days (*: compared with control group, P<0.05; **: compared with control group, P<0.01)

A：對照組；B：實驗組 A: Control group; B: Experimental group圖4 術(shù)后不同時間點橈骨標(biāo)本大體觀察Fig. 4 Gross observation of radius at different time points after surgery

2.5 影像學(xué)檢查

對照組在第4周時未見明顯骨痂形成，缺損處由軟組織填充，術(shù)后第8周時可見骨缺損斷端骨痂形成向缺損處延伸，第12周時少量骨痂連續(xù)，缺損范圍變小，但骨缺損依舊存在。實驗組在第4周時即可觀察到明顯骨痂形成，骨缺損部位已由新生骨痂填充，骨密度明顯增高，第8周時骨痂重塑，缺損部位骨痂密度進一步增高，第12周時骨缺損已完全修復(fù)，并可見橈骨髓腔已再通(圖5)。

2.6 組織學(xué)檢查

對照組在移植術(shù)后第4周、8周、12周時骨缺損未能完成修復(fù)，骨缺損斷端可見大量藍染的纖維組織形成，隨時間推移，第12周時對照組可見少量新生骨組織礦化。實驗組骨缺損部位隨時間推移纖維組織逐漸被新生骨組織代替，相較于對照組可見到更多礦化的新生骨，第12周時實驗組骨缺損已完全修復(fù)，Masson染色可見大片紅色深染的已礦化的新生骨組織(圖6)。

3 討論

FGF2可以在體外促進BMSCs的增殖、軟骨分化和成骨分化，參與骨組織的形成和重塑[7]。研究證明，10 ng/mL的FGF2可在體外促進BMSCs增殖，并且在共培養(yǎng)7 d后ALP mRNA和Runx2 mRNA的表達顯著增高[1-2]。另有研究表明，F(xiàn)GF2對多種參與血管生成的細(xì)胞具有很強的促增殖作用。但FGF2的臨床應(yīng)用受到半衰期短、快速稀釋和代謝、重復(fù)注射的潛在毒性及免疫原性等的限制[3]。因此，我們設(shè)想利用基因治療的方法將FGF2應(yīng)用于骨缺損修復(fù)?；蜉d體需要滿足轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等條件[4，8-9]。殼聚糖是廣泛存在于自然界中的一種甲殼素脫乙?；苌铮哂辛己玫纳锵嗳菪?。殼聚糖及各種改性殼聚糖作為藥物緩釋載體已被廣泛研究[10-12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖經(jīng)化學(xué)改性后可作為基因載體，當(dāng)殼聚糖中的氮元素與基因中的磷元素分子量比值為20∶1時，改性殼聚糖TACS可通過正負(fù)電荷作用將基因進行包裹，表面電荷為正電荷，易被細(xì)胞內(nèi)吞進行后續(xù)轉(zhuǎn)染[13]。另外，在該結(jié)構(gòu)外面繼續(xù)包裹與TACS等質(zhì)量的HBC制成核殼結(jié)構(gòu)后，可以達到緩慢釋放TACS-pFGF2粒子進行轉(zhuǎn)染的目的[5]。

A：對照組；B：實驗組 A: control group; B: experimental group圖5 術(shù)后不同時間點橈骨X線圖片F(xiàn)ig. 5 X-ray images of radius at different time points after surgery

A：對照組；B：實驗組 A: control group; B: experimental group圖6 術(shù)后不同時間點骨缺損處Masson染色(標(biāo)尺=100 μm)Fig. 6 Masson staining of the bone defect at different time points after surgery (scale=100 μm)

前期實驗中確定了HBC@TACS-pEGFP在體外的釋放動力學(xué)。在37 ℃的TE緩沖溶液中HBC和TACS緩慢降解生成水和二氧化碳，逐漸釋放出pEGFP，在第7天時約15%的pEGFP被釋放，第15天時釋放率約50%，第30天時釋放率約70%[5]。本研究首先選用了低劑量的HBC@TACS-pFGF2在體外與BMSCs共培養(yǎng)，Western-blot證實了共培養(yǎng)后BMSCs可成功表達FGF2蛋白，并且隨時間推移蛋白表達量有增高趨勢。

細(xì)胞毒性實驗證實HBC@TACS-pFGF2可在體外促進BMSCs增殖，而且隨著pFGF2質(zhì)粒濃度的提高，BMSCs的增殖率逐漸增高，在pFGF2質(zhì)粒濃度為100 μg時BMSC增殖率可達到對照組的(154.2%±5.34%)，但是繼續(xù)提高濃度后BMSCs增殖率開始下降，這可能與過多的質(zhì)粒存在細(xì)胞毒性有關(guān)。

另外，Liu等[14]研究表明，F(xiàn)GF可以在體外通過BMP/Smad信號通路促進BMSCs增殖分化。本研究利用PCR檢測了HBC@TACS-pFGF2與BMSCs共培養(yǎng)后相關(guān)成骨基因與成血管基因的mRNA表達情況，證實HBC@TACS-pFGF2可提高ALP和CD31基因的表達。因此，我們大膽猜測，HBC@TACS-pFGF2可以在體內(nèi)骨缺損部位轉(zhuǎn)染BMSCs提高成骨基因、成血管相關(guān)基因的表達，以促進骨缺損的修復(fù)過程。

本研究建立兔雙側(cè)橈骨18 mm缺損模型，實驗組植入明膠海綿和HBC@TACS-pFGF2微球，對照組不作植入。移植術(shù)后第4周、8周、12周收集標(biāo)本分別進行大體觀察、X線檢查、Masson染色等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周、8周、12周時，實驗組兔橈骨缺損處的骨缺損斷端橋接情況、骨密度以及新生骨礦化程度均優(yōu)于對照組。值得注意的是，兔橈骨與尺骨在解剖上存在連續(xù)，因此在制備橈骨缺損模型后兔前肢的承重可由尺骨承擔(dān)，橈骨在此期間可不參與負(fù)重，這與人體在骨缺損后的愈合過程可能存在不同。另外，兔的18 mm的骨缺損臨界值與人的骨缺損臨界值存在差異。

綜上所述，HBC@TACS-pFGF2應(yīng)用于骨缺損部位可以縮短骨缺損的愈合時間。實驗中pFGF2質(zhì)粒濃度為100 μg/mL，骨缺損修復(fù)的過程與pFGF2質(zhì)粒的劑量有無關(guān)系，以及多種基因聯(lián)合應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)效果如何，仍有待研究。另外，本實驗采用明膠海綿作為緩釋基因載體的負(fù)載材料，可用于非承重骨缺損的修復(fù)，應(yīng)用于承重骨缺損處則存在一定缺陷。