徐 峰，胡珊珊，謝時帥1,，牛萬祥1,，董永飛1,，程傳東1,，牛朝詩1,

神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長迅速、侵襲能力強，這可能與惡性腫瘤中存在缺氧/復(fù)氧微環(huán)境有關(guān)[1]。惡性膠質(zhì)瘤一經(jīng)確診，以手術(shù)切除為主，放化療為輔，總體治療效果不佳。近年來，Germano et al[2]研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stem cells,GSCs)大量存在于神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，它能在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮重要作用(如惡性增殖、侵襲和腫瘤血管生成等)。GSCs大多數(shù)存在于干細胞巢中，在膠質(zhì)瘤的缺氧微環(huán)境中發(fā)揮保護作用。Bao et al[3]通過研究發(fā)現(xiàn)GSCs能分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular epidermal growth factor,VEGF)促進腫瘤周圍的血管內(nèi)皮細胞(human brain mircrovascular endothelial cells，HBMECs)大量增生，抑制其凋亡。研究[4]表明，腫瘤細胞分泌的外泌體囊泡可以在細胞與細胞之間轉(zhuǎn)運如生長因子之類，從而發(fā)揮物質(zhì)交換及信息傳遞等作用。該研究旨在探討在體外實驗中，GSCs來源的外泌體是否對缺氧/復(fù)氧損傷的血管內(nèi)皮細胞有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料HBMECs購自美國ScienCell公司；人來源U87膠質(zhì)瘤細胞株購自中科院上海細胞庫。無外泌體血清購自美國SBI公司；一抗(von Willebrand factor,Vwf)購自武漢博士德公司；FITC標(biāo)記的二抗(羊抗小鼠)和FITC標(biāo)記的驢抗兔購自美國Jackson公司；Neun抗體購自美國Millipore公司；DMEM、1640細胞培養(yǎng)液、DMEM/F-12細胞培養(yǎng)液、B27添加劑 、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)均購自美國Gibco公司；BCA試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光顯影液購自美國MILLIPORE公司；GFAP單克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司；CDl33單克隆抗體及CD63小鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司；Neun抗體購自美國Millipore公司。細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自合肥BIOMIKY公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司；熒光顯微鏡購自德國Leica公司；流式細胞儀和超高速離心機購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1GSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

1.2.1.1 GSCs的分離及培養(yǎng) 將U87膠質(zhì)瘤細胞株在DMEM完全培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)，隨后收集U87進行消化、離心，將重懸后的細胞迅速轉(zhuǎn)移至干細胞培養(yǎng)液(DMEM/F-12細胞培養(yǎng)液、2% B27、20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF)中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長72 h后，收集細胞上清液，為后續(xù)實驗準(zhǔn)備。

1.2.1.2 GSCs的鑒定 ① GSCs的干細胞標(biāo)志物鑒定：收集培養(yǎng)的腫瘤球細胞，轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的防脫載玻片上，在培養(yǎng)箱中放置4 h待細胞貼壁，添加適量多聚甲醛固定細胞，充分清洗后，分別加入1 ∶400 Nestin IgG抗體(一抗)和CD133 IgG抗體(一抗)，4 ℃孵育過夜，清洗后加入對應(yīng)的FITC標(biāo)記二抗(1 ∶400)，37 ℃條件下孵育1 h，加入DAPI染細胞核1 h(嚴(yán)格避光處理)，最后在熒光顯微鏡下拍取照片。② GSCs的誘導(dǎo)分化實驗：將腫瘤球細胞消化、離心后轉(zhuǎn)移至有多聚左旋賴氨酸涂層的蓋玻片上進行細胞誘導(dǎo)分化實驗，添加DMEM完全培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)，5 d后，同上述操作方法進行GFAP染色處理，14 d后進行Neun熒光染色，分別在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍取照片。

1.2.2GSCs-Exo的提取、鑒定及攝取

1.2.2.1 GSCs-Exo的提取 將收集細胞上清液培養(yǎng)液(200 ml)，參照QIAGEN試劑盒說明書提取GSCs-Exo。BCA蛋白試劑盒檢測GSCs-Exo樣品中蛋白質(zhì)的水平并定量，-80 ℃條件下保存。

1.2.2.2 GSCs-Exo鑒定 ① 20 μl提取的GSCs-Exo樣品固定在Formvar-carbon載樣銅網(wǎng)上，在室溫條件下，靜置5 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體。隨后，在銅網(wǎng)上添加10 μl的3 %磷鎢酸溶液，室溫環(huán)境下放置5 min晾干，最后，置于透射電鏡的樣品室中，觀察GSCs-Exo樣品的電鏡下的形態(tài)，并拍攝照片。② 利用Western blot鑒定外泌體標(biāo)志蛋白：將提取的GSCs-Exo樣品用RIPA裂解液處理后，加入5×SDS上樣緩沖液充分混勻，100 ℃中放置10 min，取30 μl樣品采用SDS-PAGE電泳后，后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，在含脫脂牛奶(5%)的TBST液中室溫封閉2 h，清洗后加入CD63小鼠單克隆抗體(1 ∶400)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次(每次10 min)后二抗(1 ∶400)孵育2 h，再用TBST清洗3次后，ECL曝光拍照。

1.2.2.3 攝取 將生長狀況良好的U87細胞消化、離心、重懸后，用于本實驗研究(1×105/孔)，于干細胞培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，隨后采用最終濃度為2 μl/ml的染色劑CM-Dil處理4代的腫瘤球細胞， 72 h后將腫瘤細胞球移至常規(guī)干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，留取上清培養(yǎng)液200 ml，同上述方法提取外泌體，在準(zhǔn)備好蓋玻片的6孔板中接種HBMECs，細胞貼壁之后，添加CM-Dil處理過的60 μg/ml GSCs-Exo樣品常規(guī)培養(yǎng)，72 h后用多聚甲醛固定，清洗后加入兔抗人vWF(一抗，1 ∶400)，參照上述實驗方法，加入對應(yīng)FITC標(biāo)記的驢抗兔(二抗，1 ∶1 000)，激光共聚焦顯微鏡下采集照片。

1.2.3HBMECs的缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立 參照Gao et al[5]建立實驗?zāi)Ｐ?，待HBMECs生長達70%～80%后，換去原有的完全培養(yǎng)液，后添加無血清-無糖培養(yǎng)液(細胞缺氧液)，置于缺氧小室中且不斷通入混合氣體(95% N2+5% CO2)，待小室內(nèi)氧氣排盡后，將小室置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，加入含10%的無外泌體血清的1640完全培養(yǎng)液正常培養(yǎng)1 h進行復(fù)氧。

1.2.4實驗分組 HBMECs進行隨機分組處理：① 對照組(CON)：內(nèi)皮細胞正常培養(yǎng)；② 缺氧/復(fù)氧組(H/R)：內(nèi)皮細胞進行缺氧5 h/復(fù)氧1 h處理；③ GSCs-exo+H/R組：含GSCs-exo終濃度為60 μg/ml加入無血清1640培養(yǎng)基孵育內(nèi)皮細胞10 h后進行H/R處理。

1.2.5HBMECs活力的檢測 將HBMECs接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按每孔5×103個。根據(jù)實驗分組后每孔加入10 % CCK-8混合液(總?cè)萘繛?00 μl)，培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育2 h后，酶標(biāo)儀上450 nm波長處測定3組細胞吸光度。

1.2.6HBMECs遷移的檢測 參照實驗分組，將Transwell室放置24孔板中，下室加入無外泌體血清的細胞培養(yǎng)液750 μl，上室加入200 μl無血清培養(yǎng)的HBMECs，細胞計數(shù)為2×105個，培養(yǎng)過夜后將3組細胞用多聚甲醛固定，用結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 將HBMECs以1×106個/孔接種在6孔板中，參照實驗分組，H/R結(jié)束后，收集細胞。在500 μl的Annex-in-V Binding Buffer中重懸HBMECs，再每組等量加入5 μl An-nexin-V-FITC和5 μl PI后上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 GSCs的鑒定GSCs的鑒定結(jié)果如下所示：① 將本實驗培養(yǎng)的腫瘤球細胞進行神經(jīng)巢蛋白(Nestin)和CD133免疫熒光染色，鏡下可見其細胞質(zhì)被染色成功，表明培養(yǎng)的腫瘤細胞球中特異性表達Nestin和CD133(圖1)。② 進一步誘導(dǎo)分化實驗中，5 d后鏡下可見細胞球分化成膠質(zhì)細胞樣進行GFAP熒光染色處理，2周后可見其分化成神經(jīng)元細胞樣時，進行Neun熒光染色，如圖2所示，證實GFAP和Neun兩者表達均為陽性。

圖1 GSCs特異性表達Nestin和CD133 免疫細胞化學(xué)染色 ×40

圖2 誘導(dǎo)分化后證實 GSCs表達GFAP和Neun(bar=20μm)

2.2 GSCs-exo的鑒定和攝取在透射電鏡(圖3)下可見，GSCs-Exo樣品形態(tài)呈圓形的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，直徑在30 nm左右。Western blot證實GSCs-Exo蛋白樣品內(nèi)明顯表達CD63(圖4)。共聚焦顯微鏡下(圖5)可見細胞內(nèi)有紅色顆粒樣結(jié)構(gòu)，即攝取的GSCs-Exo。

圖3 GSCs-Exo形態(tài)圓形或橢圓形的膜性囊泡結(jié)構(gòu)

圖4 Western blot檢測GSCs-Exo特異性標(biāo)志物CD63的表達情況

圖5 HBMECs攝取GSCs-Exo(bar=20 μm)

A：含10%無外泌體血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的HBMECs；B：HBMECs內(nèi)可見紅色顆粒樣結(jié)構(gòu)，即攝取的GSCs-Exo

2.3 GSCs-Exo對HBMECs活性的影響血管內(nèi)皮細胞活力分別為：與CON組(1.01±0.12)比較，H/R組(0.61±0.10)內(nèi)皮細胞活力明顯降低，與H/R組比較，GSCs-Exo+H/R組(0.79±0.12)細胞活力明顯提升，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=87.35，P<0.05)，證實GSCs-Exo可以明顯增加HBMECs的活力。

2.4 GSCs-Exo對HBMECs遷移的影響如圖6，各組細胞的遷移數(shù)：CON組：(225±22.07)個/視野，GSCs-Exo+H/R組：(179±12.34)個/視野，H/R組：(101±6.56)個/視野。3組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=51.782，P<0.05)。

2.5 GSCs-exo對HBMECs凋亡的影響結(jié)果表明，CON組凋亡細胞較少[FITC+PI-:(4.2±1.6)%]，H/R組則出現(xiàn)大量凋亡細胞[FITC+PI-: (25.0±4.0)%]，與H/R組相比，GSCs-exo+H/R組凋亡細胞明顯減少[FITC+PI-:(14.2±2.0)%]，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=71.85，P<0.05)(圖7)。

圖6 GSCs-Exo對HBMECs遷移的影響 ×200

圖7 GSC-Exo對HBMECs凋亡的影響

A：CON組；B：H/R組；C：GSCs-Exo+H/R組；D：各組細胞凋亡率；與CON組比較：*P<0.05；與H/R組比較：#P<0.05；1：CON組；2：H/R組；3：GSCs-Exo+H/R組

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種較為常見的腦惡性腫瘤，由于長期處于高代謝狀態(tài)，從而引起其自身耗氧量明顯增多，最終導(dǎo)致腫瘤缺氧微環(huán)境的形成。Dvorak et al[6]研究發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的腫瘤為了應(yīng)對其自身的缺氧微環(huán)境，存在腫瘤血管增生的過程完成復(fù)氧，證實了腫瘤中存在缺氧/復(fù)氧微環(huán)境。

He et al[7]發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中確實存在膠質(zhì)瘤干細胞巢，且與其本身的病理級別密切相關(guān)，其病理級別越高，干細胞巢的分布則更加廣泛。研究[8]表明，膠質(zhì)瘤干細胞巢由GSCs、各種膠質(zhì)瘤細胞、大量微血管等組成，微血管內(nèi)皮細胞是其干細胞巢的重要成分。Calabrese et al[9]進一步證實了膠質(zhì)瘤干細胞巢的位置與血管緊密相關(guān)，常常分布于缺氧血管的周圍，這表明GSCs與血管內(nèi)皮細胞之間有著密切聯(lián)系。

外泌體是人體內(nèi)多種細胞(包括神經(jīng)細胞、腫瘤細胞等)分泌的一種胞外囊泡，其內(nèi)含有microRNAs、mRNAs、蛋白(CD9、CD63等)、脂質(zhì)、細胞因子等[10]。研究[11]證實，外泌體與腦腫瘤、帕金森等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有一定的關(guān)系。Kahlert et al[12]研究證實，腫瘤細胞分泌的外泌體可以介導(dǎo)腫瘤細胞與其微環(huán)境之間的相互作用，從而影響其自身的發(fā)生、發(fā)展、惡性增殖及血管生成等。

Najbauer et al[13]研究發(fā)現(xiàn)CD133和Nestin是GSCs的特異性標(biāo)志物，且CD133表達陽性的腫瘤球細胞誘導(dǎo)分化的細胞GFAP染色呈陽性反應(yīng)，本實驗培養(yǎng)的GSCs同時表達CD133和Nestin，且誘導(dǎo)分化后特異性表達GFAP，證實成功培養(yǎng)及鑒定了GSCs，同時提取GSC-exo，并對其作出鑒定。在體外模擬HBMECs缺氧/復(fù)氧條件，發(fā)現(xiàn)與CON組相比，H/R組HBMECs活力顯著降低，凋亡細胞數(shù)增加明顯，表明缺氧環(huán)境會對血管內(nèi)皮細胞造成很大的損害，另一方面，本實驗研究結(jié)果表明，與H/R組比較，GSCs-Exo+H/R組中的GSCs-exo樣品被HBMECs成功攝入，HBMECs的活力明顯提升，遷移能力顯著增加，凋亡細胞數(shù)隨之也顯著降低，在體外實驗中，成功證實了GSCs-Exo可以保護缺氧/復(fù)氧損傷的血管內(nèi)皮細胞，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡。同時，進一步證實了GSCs-Exo能夠介導(dǎo)GSCs與其腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮細胞之間的相互作用。Hundsberger et al[14]研究表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個重要特征就是大量微血管增生，大量微血管生成可以很好地滿足膠質(zhì)瘤的生長所需，提供諸如氧氣、蛋白質(zhì)及其他營養(yǎng)產(chǎn)物。Kobina et al[15]發(fā)現(xiàn)GW4869是一種鞘磷酶抑制劑，能抑制細胞來源的外泌體分泌，且在腫瘤的增殖、遷移、腫瘤血管生成及抗放療等方面有一定的抑制作用。結(jié)合本課題組目前所做的研究，為進一步靶向膠質(zhì)瘤微環(huán)境治療提供新的途徑。

綜上所述，在缺氧/復(fù)氧微環(huán)境中，膠質(zhì)干細胞與血管內(nèi)皮細胞可以通過GSCs-Exo傳遞生物學(xué)信息從而發(fā)揮作用，因此，可以以外泌體為靶向開辟膠質(zhì)瘤治療新的道路，具體的作用機制有待進一步探究。