施 伍，賈 欣，梁 悅，胡丹丹，王烈成，張 玲

右美托咪定(dexmedetomidine, DEX)是一種高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，廣泛應(yīng)用于臨床的輔助麻醉和重癥監(jiān)護(hù)[1-2]。DEX具有明顯的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用[3- 4]，然而其鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛的中樞機(jī)制尚未完全闡明。腦干藍(lán)斑(locus coeruleus，LC)是腦內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)元聚集的主要核團(tuán)，由LC發(fā)出的纖維向上可以到達(dá)皮層廣泛區(qū)域參與覺醒和睡眠，由LC向下發(fā)出的纖維到達(dá)脊髓構(gòu)成內(nèi)源性的疼痛下行抑制調(diào)控環(huán)路[5-6]。大量的研究[7-9]表明DEX在腦內(nèi)的作用的主要靶點(diǎn)是LC且DEX和嗎啡具有協(xié)同作用[10]?，F(xiàn)利用在體電生理技術(shù)在自由活動的小鼠上記錄系統(tǒng)性給予不同劑量DEX對LC神經(jīng)元放電的影響，并結(jié)合行為學(xué)和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究DEX的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用的關(guān)系和中樞機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑DEX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司；納洛酮購自上海愛必信公司；育亨賓購自美國Sigma公司。c-Fos一抗購自美國abcam公司；p-ERK一抗購自美國CST公司；二抗購自美國Invitrogen公司。實(shí)驗(yàn)動物選用成年健康的SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，共52只，由上海市實(shí)驗(yàn)動物資源中心(西普爾-必凱公司)提供，按照實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例進(jìn)行飼養(yǎng)，動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海同濟(jì)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1機(jī)械縮足閾值的測定 提前將小鼠放入高架金屬網(wǎng)底板的鐵籠中適應(yīng)30 min。測試時(shí)，用Von Frey纖維絲垂直刺小鼠后爪腳底，各纖維絲之間需間隔5 s，小鼠在受刺激時(shí)若出現(xiàn)快速抬足、抖足或舔足中的任意一種現(xiàn)象，此次刺激反應(yīng)即被視為陽性反應(yīng)，用up-down方法統(tǒng)計(jì)分析小鼠機(jī)械縮足閾值。

1.2.2熱甩尾潛伏期的測定 熱甩尾實(shí)驗(yàn)中，用軟毛巾將小鼠的身體輕輕包住，只露出尾巴，注意頭部尤其眼部遮光可以使小鼠盡量安靜，將小鼠尾端3～4 cm的尾巴浸入48、50、52 ℃的水浴鍋中，為防止小鼠尾巴燙傷，每次測試間隔應(yīng)大于10 s，以尾回縮出水面的潛伏期，即熱甩尾潛伏期為測定痛域的指標(biāo)。

1.2.3鞘內(nèi)注射 使用微量注射器在小鼠L4-5椎間隙進(jìn)針，當(dāng)出現(xiàn)輕微甩尾反射則視為成功，30 s內(nèi)注射完10 μl藥物，并剔除有運(yùn)動障礙的動物。

1.2.4鎮(zhèn)靜評定 將單個(gè)小鼠置于干凈的飼養(yǎng)籠中，讓其自由活動，待測小鼠經(jīng)過30 min的適應(yīng)后，采用Chuck的鎮(zhèn)靜評定量表對其行為進(jìn)行評分。

1.2.5電極制作 電極由16根單獨(dú)絕緣的鎳鉻合金線(內(nèi)徑35 μm，阻抗300～900 KΩ; Stablohm 675，California Fine Wire)組成。16根微線陣列以4×4×4×4圖案排列(線之間約200 μm間距)。焊接到18針連接器(Mil-Max)上，焊接處用AB膠封固，裸露的鎳鉻合金線用聚乙二醇2000保護(hù)。

1.2.6電極埋植 將用異氟烷誘導(dǎo)麻醉的小鼠固定于定位儀上，手術(shù)期間持續(xù)氣體麻醉(誘導(dǎo)3%，維持1.5%)，涂抹金霉素眼膏保護(hù)小鼠眼睛，剪開頭皮暴露顱骨，將小鼠顱骨調(diào)整至符合定位標(biāo)準(zhǔn)的位置。用定位電極在顱骨標(biāo)記埋植位點(diǎn)，用顱骨鉆在該位點(diǎn)開窗。將自制的微絲電極陣列從開窗部位插入LC上方(前后距：5.20 mm，旁開距：0.92 mm，深度：3.58 mm)，埋植前將電極陣列頭端沾取少許Neuro-DiI染料(Biotium，美國)，以便后期確定埋植位置。將參考電極纏繞到兩個(gè)顱釘上后擰緊。將3M Vetbang組織膠(美國3M公司)涂抹于顱骨和顱釘表面，之后迅速用牙科水泥將裸露的電極和顱骨封蓋。待牙科水泥堅(jiān)硬后將小鼠取下，放到電熱毯上保溫以加快術(shù)后恢復(fù)。

1.2.7在體電生理記錄 神經(jīng)元信號記錄應(yīng)在安靜房間中的屏蔽箱中進(jìn)行，并在小鼠電極埋植恢復(fù)7 d后開始，為了減少電極脫落的風(fēng)險(xiǎn)，記錄前將小鼠用異氟烷輕度麻醉后，迅速將埋植在小鼠頭上的電極與記錄系統(tǒng)相連接，將小鼠放在記錄箱中自由活動30 min以適應(yīng)環(huán)境，使用多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)同步采集小鼠腹腔注射DEX之后鞘內(nèi)注射納洛酮或育亨賓后的實(shí)時(shí)LC神經(jīng)元電信號，采樣頻率為500 Hz，記錄40 min。

1.2.8在體電生理數(shù)據(jù)分析 為了篩選出高質(zhì)量的單細(xì)胞聚集波，用Offline Sorter軟件去掉明顯的雜波，經(jīng)篩選的數(shù)據(jù)用NeuroExplorer(Nex Technologies，美國)軟件分析，可得出LC神經(jīng)元的放電頻率的變化圖表。

1.2.9免疫組織化學(xué) 切好的腦片漂洗2次，液室溫封閉1 h后，棄封閉液，加入一抗(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜，再棄一抗漂洗3次后加二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育2 h后棄二抗，漂洗3次后將腦片貼在載玻片上，封片拍攝。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射DEX對小鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用為了明確DEX是否影響小鼠機(jī)械痛，給予小鼠腹腔注射不同劑量的DEX (0～20 μg/kg) ，每組5只，20 min后使用Von Frey纖維絲測量小鼠機(jī)械痛。結(jié)果顯示，DEX增加小鼠的機(jī)械痛閾，并且鎮(zhèn)痛作用具有劑量依賴性 (圖1 A)。值得注意的是，腹腔注射DEX在10 μg/kg或以下劑量時(shí)，小鼠的痛閾值沒有明顯改變，只有當(dāng)DEX濃度升高到12 μg/kg及以上，小鼠機(jī)械痛閾值明顯升高。

為了明確DEX的鎮(zhèn)痛作用是否由鎮(zhèn)靜效應(yīng)引起，課題組除了測量不同劑量DEX對小鼠的痛閾值的影響以外，同時(shí)還對小鼠的鎮(zhèn)靜行為進(jìn)行評分。根據(jù)小鼠的行為從清醒到睡眠依次以0～5分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(具體評分標(biāo)準(zhǔn)見材料與方法)。結(jié)果顯示，腹腔注射DEX 10～16 μg/kg時(shí)，小鼠并沒有明顯的鎮(zhèn)靜作用，而腹腔注射DEX升高到18 μg/kg及以上時(shí)，出現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的鎮(zhèn)靜作用 (圖1 B)。以上結(jié)果提示，DEX在小鼠表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜雙重作用，低劑量時(shí)主要表現(xiàn)為鎮(zhèn)痛，高劑量時(shí)則出現(xiàn)鎮(zhèn)靜作用，并且DEX的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用均具有劑量依賴性。

2.2 DEX對LC神經(jīng)元放電的影響在小鼠LC埋植記錄電極(圖2G)，使用多通道在體電生理技術(shù)記錄LC神經(jīng)元放電(圖2E)，在小鼠腹腔注射DEX 20 min后記錄DEX對LC神經(jīng)元放電的影響，并與給藥前進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)顯示低劑量的DEX(6 μg/kg)可引起45.5%(10/22)的LC神經(jīng)元放電頻率增加(圖2C、D)，18.2%(4/22)的神經(jīng)元放電頻率降低，36.3%(8/22)放電頻率不變，記錄細(xì)胞總數(shù)22作為分母 (圖2F)；而高低劑量DEX(20 μg/kg)則引起大部分(90%，34/38)LC神經(jīng)元放電抑制 (圖2A、B)，5%(2/38)的LC神經(jīng)元放電增加，5%(2/38)不變，記錄細(xì)胞總數(shù)38作為分母(圖2 F)。該結(jié)果提示，不同劑量的DEX對LC神經(jīng)元的活動產(chǎn)生不同的作用。

2.3 較高劑量的DEX(20 μg/kg)降低LC去甲腎上腺素能神經(jīng)元活性為了確定腹腔注射DEX所致的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用是否有LC去甲腎上腺素能神經(jīng)元的參與，給予小鼠腹腔注射6、20 μg/kg DEX，運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法對LC神經(jīng)元c-Fos和p-ERK表達(dá)做定性定量分析，并對LC去甲腎上腺素能神經(jīng)元進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，腹腔注射DEX(6 μg/kg)會引起LC去甲腎上腺素能神經(jīng)元活動增加(圖3 A)。腹腔注射DEX(20 μg/kg)會引起LC去甲腎上腺素能神經(jīng)元活動下降(圖3 B)。統(tǒng)計(jì)各斷面被激活的去甲腎上腺素能神經(jīng)元與所有去甲腎上腺素能神經(jīng)元的比值發(fā)現(xiàn)，在距離Bregma點(diǎn)-5.34 mm和-5.40 mm 2個(gè)斷面，與腹腔注射DEX 6 μg/kg 相比，20 μg/kg LC去甲腎上腺素能神經(jīng)元活性顯著下降(圖3C、D)。

2.4 DEX對小鼠的鎮(zhèn)痛作用由脊髓α2受體介導(dǎo)為了研究DEX的鎮(zhèn)痛機(jī)制，給予小鼠腹腔注射DEX(14 μg/kg)20 min后于鞘內(nèi)注射α2受體拮抗劑育亨賓(0.03 μg溶于10 μl PBS)。熱甩尾實(shí)驗(yàn)顯示，DEX(14 μg/kg)明顯增加小鼠在48、50、52 ℃熱水中的甩尾潛伏期并且DEX抑制小鼠熱痛敏的作用可被育亨賓阻斷 (圖4A)。 Von Frey實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示育亨賓阻斷DEX對機(jī)械痛的鎮(zhèn)痛作用 (圖4B)。而高劑量的DEX(20 μg/kg)的鎮(zhèn)痛及鎮(zhèn)靜作用并不受α2受體拮抗劑育亨賓(0.03 μg 溶于10 μl PBS)的影響(圖4C、D)。以上結(jié)果提示低劑量DEX抑制機(jī)械痛敏和熱痛敏的作用均由脊髓α2受體介導(dǎo)，而高劑量DEX的鎮(zhèn)靜作用不受脊髓α2受體影響。

圖1 DEX對小鼠鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用

圖2 DEX對LC神經(jīng)元放電頻率的影響

A、B：腹腔注射DEX(20 μg/kg)前(A)和后(B)的LC放電光柵圖；C、D：腹腔注射DEX(6 μg/kg)前(C)和后(D)的LC放電光柵圖；E：單個(gè)神經(jīng)元放電模式圖；F：腹腔注射DEX 20、6 μg/kg后LC放電頻率變化的細(xì)胞數(shù)的比例和分布圖；G：電極埋植位點(diǎn)示意圖×5

圖3 DEX對LC神經(jīng)元c-Fos和p-ERK表達(dá)的影響

A：腹腔注射 DEX(6 μg/kg)對LC神經(jīng)元c-Fos和p-ERK表達(dá)的情況示意圖 ×20；B：腹腔注射DEX(20 μg/kg)對LC神經(jīng)元c-Fos和p-ERK表達(dá)的情況示意圖(箭頭指TH神經(jīng)元和c-Fos或p-ERK共標(biāo)的細(xì)胞)×20；C：腹腔注射不同濃度DEX對LC神經(jīng)元c-Fos表達(dá)的情況比較；D：腹腔注射不同濃度 DEX對LC神經(jīng)元p-ERK表達(dá)的情況比較；與6 μg/kg 組比較：*P<0.05；與0 μg/kg組比較：###P<0.001，#P<0.05

圖4 低劑量的DEX對小鼠機(jī)械痛和熱痛的鎮(zhèn)痛作用均由脊髓α2受體介導(dǎo)

A：腹腔注射DEX后鞘內(nèi)注射育亨賓在不同溫度下對熱甩尾潛伏期的影響；B：腹腔注射14 μg/kg DEX后鞘內(nèi)注射育亨賓對機(jī)械痛閾的影響；C：腹腔注射20 μg/kg DEX后鞘內(nèi)注射育亨賓對機(jī)械痛域的影響；D：腹腔注射20 μg/kg DEX后鞘內(nèi)注射育亨賓對鎮(zhèn)靜評分的影響；與正常組比較：***P<0.001，*P<0.05；與DEX+溶劑組比較：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05

2.5 納洛酮不能逆轉(zhuǎn)DEX的鎮(zhèn)痛作用為研究DEX鎮(zhèn)痛效果是否與嗎啡受體相關(guān)，小鼠腹腔注射DEX(14 μg/kg)20 min后鞘內(nèi)注射納洛酮(0.03 ng 溶于10 μl PBS)并不影響小鼠的熱痛行為(圖5A)；鞘內(nèi)注射0.3 ng和30 ng納洛酮也不影響小鼠的機(jī)械痛行為(圖5B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DEX對熱痛和機(jī)械痛的鎮(zhèn)痛作用并不經(jīng)脊髓的嗎啡受體介導(dǎo)。

圖5 低劑量DEX的鎮(zhèn)痛作用不依賴嗎啡受體

A：腹腔注射DEX后鞘內(nèi)注射納洛酮對熱甩尾潛伏期的影響；B：腹腔注射14 μg/kg DEX后鞘內(nèi)注射納洛酮對機(jī)械痛閾的影響

3 討論

大量的研究[11]證明以不同的途徑給予DEX均可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但因?yàn)镈EX也有明顯的鎮(zhèn)靜作用，因此為了研究系統(tǒng)給予DEX對小鼠鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜的作用及其機(jī)制，課題組首先給小鼠腹腔注射不同劑量的DEX，觀察對小鼠機(jī)械痛閾的影響并對鎮(zhèn)靜行為進(jìn)行評分。顯示在低劑量時(shí)DEX只有鎮(zhèn)痛作用而不產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用。隨著劑量升高，DEX使小鼠出現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)靜行為，且DEX的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用均具有量效關(guān)系，這一結(jié)果提示不同劑量的DEX可能通過不同的機(jī)制產(chǎn)生鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用。

腦干的藍(lán)斑核是包括DEX在內(nèi)的多種腎上腺素α2受體的激動劑主要作用的核團(tuán)[12]。離體腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)顯示30 nmol/L的DEX可以直接通過LC神經(jīng)元膜上的腎上腺素α2受體使神經(jīng)元產(chǎn)生超激化[7]。Funai et al[13]使用在體脊髓膜片鉗技術(shù)證明腹腔給予低劑量的DEX(<10 μg/kg)可以增強(qiáng)脊髓背角神經(jīng)元的抑制性突觸后電位；而同樣劑量的DEX在LC主要產(chǎn)生興奮神經(jīng)元的作用。因此可以確定DEX不僅對不同部位的神經(jīng)元產(chǎn)生不同的作用，而且不同濃度的DEX對神經(jīng)元的作用也有所不同。然而DEX對清醒小鼠的LC神經(jīng)元活動究竟產(chǎn)生怎樣的作用至今卻未見報(bào)道。為了避免麻醉藥物的影響，進(jìn)一步明確DEX鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用的神經(jīng)機(jī)制，課題組采用多通道在體電生理記錄技術(shù)檢測了不同劑量DEX對自由活動小鼠藍(lán)斑神經(jīng)元放電的影響。顯示低劑量的DEX主要增加LC的神經(jīng)元放電頻率，而高劑量的DEX則使大部分神經(jīng)元的放電產(chǎn)生抑制。由于LC發(fā)出下行纖維主要到達(dá)脊髓構(gòu)成疼痛的下行抑制環(huán)路[12]，為了確定DEX對疼痛的調(diào)控是否由LC到脊髓的下行環(huán)路介導(dǎo)，課題組給予脊髓鞘內(nèi)注射腎上腺素α2受體阻斷劑育亨賓，結(jié)果顯示育亨賓可以阻斷DEX對熱痛和機(jī)械痛的鎮(zhèn)痛作用，這一研究結(jié)果表明了DEX激活了LC到脊髓的下行痛抑制環(huán)路并且脊髓α2受體介導(dǎo)了DEX的鎮(zhèn)痛作用。由于脊髓的α2受體可表達(dá)在LC到脊髓的下行纖維以及脊髓的神經(jīng)元中[14]，DEX的鎮(zhèn)痛作用主要由突觸前還是突觸后的α2受體介導(dǎo)仍需要進(jìn)一步的研究。然而，鞘內(nèi)給與α2受體拮抗劑并不影響高劑量DEX引發(fā)的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用，推測高劑量DEX可能通過抑制LC神經(jīng)元的活動從而抑制了LC上行的與覺醒相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用。對于不同濃度的DEX為什么會對LC神經(jīng)元興奮性和由LC構(gòu)成的神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)生不同的作用，其機(jī)制還需要進(jìn)一步地深入研究。

大量的來自臨床的研究顯示，DEX和嗎啡具有協(xié)同作用，DEX與嗎啡同時(shí)使用可以降低嗎啡使用量，具有減少嗎啡成癮的作用[10]。為了研究DEX的鎮(zhèn)痛作用是否為嗎啡受體依賴，課題組給予小鼠鞘內(nèi)注射納洛酮，顯示DEX對熱痛和機(jī)械痛的鎮(zhèn)痛作用均不受納絡(luò)酮影響，提示DEX的鎮(zhèn)痛作用并不依賴嗎啡受體。