徐 瑤，鄧曉楊, 張 勇,3，吳 雯，肖 琳，張小虎

卵巢癌是一類發(fā)病率較高的婦科惡性腫瘤，死亡率在婦科惡性腫瘤中居首[1]。調(diào)查[2]顯示，約65%的卵巢癌患者處于癌癥晚期，經(jīng)手術(shù)及放化療后仍預(yù)后不良，5年生存率≤30%。此外，近年來(lái)卵巢癌患者趨于低齡，卵巢癌發(fā)病率逐年遞增[3]，因此尋找有效治療方法顯得十分迫切。微小型RNA miR-206在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用，可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和癌組織的轉(zhuǎn)移[4]。而miR-206在卵巢癌中的抑癌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。因此，該文通過(guò)上調(diào)miR-206，對(duì)其在卵巢癌細(xì)胞CAOV3中的作用機(jī)制進(jìn)行了深入探究，為miR-206靶向治療卵巢癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑卵巢癌細(xì)胞CAOV3購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；TRIzol及Opti-MEM均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-206 mimic和pc-MAPK1質(zhì)粒由上海生工生物設(shè)計(jì)并合成；Brdu試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；促分裂原活化蛋白激酶1 (mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)、上皮型鈣黏附蛋白(epithelial calcium adhesive protein，E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CAMP reactive element binding protein，CREB)、P-CREB、Ets樣轉(zhuǎn)錄因子-1(Ets-like transcription factor-1，Elk-1)、P-Elk-1、原癌基因(proto-oncogene，c-Myc)及P-c-Myc兔來(lái)源單克隆一抗抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；實(shí)驗(yàn)所用二抗均購(gòu)自上海博士德生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、DAPI及BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640，37℃、5% CO2培養(yǎng)。細(xì)胞傳代次日換液，融合率達(dá)到85%時(shí)，以1×104個(gè)/ml的濃度再次傳代。將細(xì)胞分為Control、miR-206 mimic、pc-MAPK1及miR-206 mimic+pc-MAPK1組，根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)將miR-206 mimic質(zhì)粒、pc-MAPK1質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入miR-206 mimic、pc-MAPK1及miR-206 mimic+pc-MAPK1組CAOV3細(xì)胞，Control組加入等量空載。轉(zhuǎn)染6 h后換液，用于后續(xù)研究。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-206及MAPK1 mRNA水平將經(jīng)或未經(jīng)miR-206轉(zhuǎn)染的CAOV3細(xì)胞及其移植瘤組織中加入TRIzol于通風(fēng)櫥中裂解，參考Thermo Fisher總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提，將得到的總RNA進(jìn)行定量分析，每組取等量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒配制PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到閾值Δct，以對(duì)照組2ΔΔCt平均值為基準(zhǔn)1，實(shí)驗(yàn)組2ΔΔCt平均值與對(duì)照組2ΔΔCt平均值相比得到的2ΔΔCt為相對(duì)變化倍數(shù)。

1.4 Brdu檢測(cè)CAOV3細(xì)胞增殖1.2中各組細(xì)胞以1.5×105個(gè)/ml的濃度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L Brdu孵育8 h，PBS洗去未結(jié)合Brdu，以含95%乙醇、5%冰乙酸的固定液固定細(xì)胞，洗滌后加入Brdu單抗(1 ∶1 000)4℃過(guò)夜，二抗(1 ∶200)室溫避光孵育1 h。洗滌后DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。

1.5 Transwell檢測(cè)CAOV3細(xì)胞侵襲Matrigel于4℃預(yù)先融化，取少量融化Matrigel到Transwell小室中預(yù)包被。接種1.2中各組細(xì)胞于上室中，用無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后，棉簽拭去濾膜上層未遷移細(xì)胞，HE染色液對(duì)遷移下層細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)。

1.6 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)RIPA裂解液提取1.2中各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行定量并調(diào)平，取各組蛋白30 μg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% SDS-PAGE將其分離，半干轉(zhuǎn)膜法將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉2 h室溫封閉，一抗(GAPDH：1 ∶1 000，MAPK1：1 ∶1 000，vimentin：1 ∶1 000，E-cadherin：1 ∶1 000，P-CREB：1 ∶1 000，CREB：1 ∶1 000，P-Elk-1：1 ∶1 000，Elk-1：1 ∶1 000， P-c-Myc：1 ∶500，c-Myc：1 ∶500)4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗(1 ∶2 000)37℃ 1 h，最后曝光顯色并以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-206與MAPK1靶向關(guān)系生物信息網(wǎng)站TargetScan預(yù)測(cè)hsa-miR-206與MAPK1之間存在潛在靶向關(guān)系。與Control組相比，miR-206 mimic組miR-206表達(dá)上調(diào)(t=4.86，P<0.001)。各組間MAPK1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=338.125，P=0.003)；與Control組相比，miR-206 mimic組MAPK1表達(dá)下調(diào)(t=3.34，P=0.009)，pc-MAPK1組MAPK1表達(dá)上調(diào)(t=3.38，P=0.008)；與miR-206 mimic組比較，mimic+pc-MAPK1組MAPK1表達(dá)上調(diào)(t=3.35，P=0.009)。各組間熒光素酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=187.364，P=0.006)；轉(zhuǎn)染miR-206 mimic可降低MAPK1 wt的熒光素酶活性，而對(duì)兩者結(jié)合位點(diǎn)突變的MAPK1 mut沒(méi)有影響。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-206 mimic及pc-MAPK1對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖影響4組間熒光素酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=543.297，P=0.000)；與Control組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比(68.12±9.23)%比較，miR-206 mimic組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比(9.54±5.12)%下降(t=4.27，P=0.002)，pc-MAPK1組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比(94.34±6.27)%上升(t=3.45，P=0.008)。與miR-206 mimic組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比(9.54±5.12)% 比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比(56.62±7.13)%上升(t=4.11，P=0.003)。見(jiàn)圖2。

2.3 miR-206 mimic及pc-MAPK1對(duì)CAOV3細(xì)胞侵襲影響4組間熒光素酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=621.377，P=0.000)；與Control組侵襲細(xì)胞數(shù)(55.12±9.23)比較，miR-206 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)(11.14±5.17)減少(t=3.43，P=0.008)，pc-MAPK1組侵襲細(xì)胞數(shù)(164.22±23.21)增多(t=3.52，P=0.007)。與miR-206 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)(11.14±5.17)比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組侵襲細(xì)胞數(shù)(45.32±9.11)增多(t=3.33，P=0.009)。見(jiàn)圖3。

2.4 miR-206 mimic及pc-MAPK1對(duì)CAOV3細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響4組間E-cadherin表達(dá)量和vimentin表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=623.764，P=0.000；F=889.463，P=0.000)。與Control組比較，miR-206 mimic組細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增加(t=4.13，P=0.003)、vimentin表達(dá)減少(t=3.51，P=0.007)，pc-MAPK1組E-cadherin表達(dá)減少(t=3.27，P=0.010)、vimentin表達(dá)增加(t=3.31，P=0.009)。與miR-206 mimic組比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組E-cadherin表達(dá)減少(t=4.02，P=0.003)，vimentin表達(dá)增加(t=3.36，P=0.009)。見(jiàn)圖4。

圖1 miR-206與MAPK1靶向關(guān)系

A：miR-206與MAPK1之間的連續(xù)結(jié)合片段；B：miR-206 mimic對(duì)miR-206影響；C：miR-206 mimic及pc-MAPK1對(duì)MAPK1影響；D：熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-206與MAPK1靶向關(guān)系；與Control組比較：**P<0.01；與miR-206 mimic組比較：##P<0.01；與MAPK1mut組比較：△△P<0.01

圖2 BrdU染色檢測(cè)各組CAOV3細(xì)胞增殖情況 BrdU×400

圖3 Transwell檢測(cè)各組CAOV3細(xì)胞侵襲情況 結(jié)晶紫×400

圖4 Western blot法檢測(cè)各組CAOV3細(xì)胞vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)

與Control組比較：**P<0.01，與 miR-206 mimic組比較：##P<0.01

2.5 miR-206 mimic及pc-MAPK1對(duì)CAOV3細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響各組間P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1、P-c-Myc/c-Myc表達(dá)量比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=468.392，P=0.000；F=143.674，P=0.001；F=697.314，P=0.000)。與Control組比較，miR-206 mimic組細(xì)胞中P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值降低(t=3.27，P=0.010；t=3.26，P=0.010；t=3.28，P=0.010)，pc-MAPK1組P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值升高(t=3.31，P=0.009；t=3.29，P=0.010；t=3.34，P=0.009)。與miR-206 mimic組比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值升高(t=3.27，P=0.010；t=3.28，P=0.010；t=3.29，P=0.010)。見(jiàn)圖5。

2.6 miR-206 mimic對(duì)CAOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤影響與Control組裸鼠皮下移植瘤體積(2134.26±199.33)mm3比較，miR-206 mimic組(496.21±187.13)mm3減小(t=6.51，P<0.001)。與Control組相比，miR-206 mimic組移植瘤組織中miR-206表達(dá)增加(t=4.65，P=0.001)，MAPK1 mRNA水平降低(t=3.86，P=0.004)，miR-206 mimic組VEGF表達(dá)及P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值降低(t=3.37，P=0.009；t=3.34，P=0.009；t=3.40，P=0.008)，Ki67及Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞百分比減少(t=4.45，P=0.002；t=4.22，P=0.002)。見(jiàn)圖6。

圖5 Western blot法檢測(cè)各組CAOV3細(xì)胞P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc水平

3 討論

miRNA是一類用于調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的小型單鏈非編碼RNA，在各種細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miR-206作為一類抗癌基因，在卵巢癌細(xì)胞中被下調(diào)，上調(diào)miR-206表達(dá)可抑制卵巢癌發(fā)生發(fā)展[5]。miR-206可調(diào)節(jié)多個(gè)基因表達(dá)，在乳腺癌中，miR-206可靶向下調(diào)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及T-box錄因子[6]；在胃癌中，miR-206可降低c-Met、周期蛋白依賴性激酶4及MAPK1的表達(dá)水平[7]。本研究利用生物信息預(yù)測(cè)顯示，在CAOV3細(xì)胞中miR-206可靶向下調(diào)MAPK1表達(dá)。

圖6 miR-206 mimic對(duì)CAOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的影響

A：CAOV3細(xì)胞移植瘤照片；B：Western blot法檢測(cè)VEGF、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc水平；C：qRT-PCR檢測(cè)miR-206及MAPK1 mRNA水平，1：Control組；2：miR-206 mimic組；D：免疫組化檢測(cè)Ki67和vimentin表達(dá) ×200；與Control組比較：**P<0.01

過(guò)度增殖及侵襲遷移是癌細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，降低癌細(xì)胞增殖及侵襲能力可抑制癌組織生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。研究[6]表明，miR-206可靶向下調(diào)多個(gè)促癌基因，抑制癌細(xì)胞增殖及侵襲。在腎細(xì)胞癌中，miR-206通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白G相關(guān)激酶表達(dá)，降低癌細(xì)胞增殖及侵襲能力[8]；在卵巢癌中，miR-206抑制其靶蛋白細(xì)胞周期蛋白D1及D2表達(dá)，阻礙癌組織的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[5]。在本文中，在卵巢癌細(xì)胞CAOV3中，miR-206可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK1抑制細(xì)胞的增殖及侵襲。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲遷移的重要因素之一，其在蛋白水平上主要表現(xiàn)為E-cadherin表達(dá)減少，Vimentin表達(dá)增加。細(xì)胞黏附蛋白E-cadherin定位于上皮細(xì)胞中，主要維持細(xì)胞極性及完整性，是細(xì)胞增殖和侵襲的抑制因子[9]。波形蛋白Vimentin是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，可作為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的經(jīng)典標(biāo)記物，在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞骨架組分由以角蛋白為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐圆ㄐ蔚鞍诪橹鱗10]。本研究表明，miR-206可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK1阻礙CAOV3細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

MAPK1信號(hào)通路在癌癥形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如，在子宮內(nèi)膜癌中，MAPK1過(guò)度激活可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖侵襲及遷移[11]。據(jù)報(bào)道[12]，在卵巢癌中，抑制MAPK1表達(dá)可提高癌細(xì)胞對(duì)鉑類化合物的敏感性。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB、Ets樣轉(zhuǎn)錄因子Elk-1及原癌基因c-Myc均為MAPK1的下游蛋白，CREB是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子，主要定位于細(xì)胞核中，當(dāng)其被MAPK1磷酸化激活后可促進(jìn)MAPK1靶基因的轉(zhuǎn)錄[13]；Elk-1是促癌基因，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄在癌組織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和血管形成中發(fā)揮重要作用[14]；c-Myc具有的增殖效應(yīng)，能使細(xì)胞具有無(wú)限增殖的能力，可促進(jìn)多種癌癥發(fā)生發(fā)展[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-206可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK1抑制MAPK1信號(hào)通路的激活。

綜上所述， miR-206過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向下調(diào)MAPK1抑制MAPK1信號(hào)通路來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞CAOV3生長(zhǎng)及運(yùn)動(dòng)，這為靶向治療卵巢癌提供新的靶點(diǎn)。但是具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。