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過表達miR-34a脂肪干細(xì)胞外泌體調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的研究

2020-07-13 03:51肖向陽鄭德義王寶云李自力
關(guān)鍵詞:外泌體纖維細(xì)胞瘢痕

肖向陽,鄭德義,王寶云,李自力

長期愈合的軟組織傷口容易形成瘢痕,這不利于傷口愈合質(zhì)量[1]。因此,縮短軟組織創(chuàng)傷愈合時間,減少瘢痕形成,是臨床急需解決的問題。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)能分泌多種可溶性因子,如生長因子、細(xì)胞因子、胞外體等[2]。外泌體是一個40~100 nm大小的細(xì)胞外小泡,形成于胞質(zhì)并釋放到細(xì)胞外環(huán)境[3]。研究[4]表明ADSCs或其外泌體能夠促進真皮成纖維細(xì)胞在傷口愈合過程中的遷移,并且在促進皮膚或黏膜軟組織創(chuàng)傷修復(fù)中有積極作用。miRNAs在細(xì)胞增殖凋亡等各種細(xì)胞反應(yīng)中具有重要要作用,研究[5]表明miR-34a在ADSCs作用中過表達能影響細(xì)胞周期及增殖,但在ADSCs外泌體干預(yù)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(hypertrophic scar fibroblasts,HSF)增殖凋亡情況中的作用尚不可知。因此該研究以HSF為研究對象,將其與過表達miR-34a的ADSCs外泌體共培養(yǎng)后,探討miR-34a在ADSCs外泌體影響HSF增殖、凋亡過程中的具體作用機制,以期為臨床研發(fā)新的治療瘢痕疙瘩的治療方案提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人脂肪組織來源于貴州省人民醫(yī)院整形外科的一名27歲進行吸脂術(shù)的健康女性,術(shù)前簽署知情同意書;HSF購自上海素冉生物科技有限公司;miR-34a過表達及其陽性對照慢病毒(2×108PFU/ml)購自上海漢恒生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清購自美國HyClone公司;胰蛋白酶和膠原酶購自美國Gibco公司;TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司;MTT試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒以及蛋白酶抑制劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;qRT-PCR 試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;兔抗人cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、Ⅰ型膠原蛋白(COL Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(COL Ⅲ)、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1和GAPDH抗體、兔抗人CD90、CD31、CD45、CD81、CD63、小鼠抗人CD105及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 均購自英國Abcam公司;ExoQuick-TC外泌體沉淀液購自美國System Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1ADSCs的分離及鑒定 用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS)洗滌脂肪組織后,將脂肪組織切成約25~50 μm的片狀,用0.1%膠原酶在37 ℃下消化1 h,通過100 μm濾網(wǎng)過濾消化物,去除組織碎片獲得單細(xì)胞懸液。1 000 r/min 離心5 min分離含有ADSCs的細(xì)胞懸液,共離心6次。將ADSCs按5×107個/ml的濃度接種于培養(yǎng)瓶中。于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,去除未貼壁細(xì)胞。每2 d換1次培養(yǎng)液,當(dāng)細(xì)胞融合率達到80%后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測ADSCs表面分子標(biāo)志物CD31、CD45、CD90、CD105的表達水平,并采用成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分離出的ADSCs 成骨分化21 d,再使用茜素紅和堿性磷酸酶染色觀察ADSCs成骨分化能力。

1.2.2細(xì)胞感染 取對數(shù)生長期ADSCs,以1×105個/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞生長至70%融合度時,按照病毒感染比率值(MOI)50 ∶1分別加入miR-34a過表達慢病毒及其陰性對照慢病毒感染ADSCs,另取選用不做任何處理的ADSCs細(xì)胞作為對照,分別記為ADSCs/miR-34a組、ADSCs/miR-NC組和ADSCs組。培養(yǎng)6 h后,更換新鮮培養(yǎng)液,72 h后采用1 mg/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達株。

1.2.3外泌體提取及鑒定 將ADSCs在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,加入胰蛋白酶消化后收集培養(yǎng)基,3 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片,通過0.22 μm微孔過濾器。得到細(xì)胞上清液,再用微孔離心過濾裝置100 000 r/min離心2 h濃縮,然后用ExoQuick-TC外泌體沉淀溶液孵育過夜。PBS將得到的外泌體重懸后,BCA測定其濃度后置于-80 ℃?zhèn)溆?。透射電子顯微鏡觀察收集到的外泌體形態(tài),通過Western blot法檢測外泌體標(biāo)志物蛋白CD63和CD81的表達。根據(jù)不同分組ADSCs細(xì)胞提取的外泌體分為3組,分別為ADSCs外泌體(ExoADSCs)、ADSCs/miR-NC外泌體(ExoADSCs/miR-NC)和ADSCs/miR-34a外泌體(ExoADSCs/miR-34a)。

1.2.4外泌體與HSF細(xì)胞共培養(yǎng) 取對數(shù)生長期HSF細(xì)胞,以5×107個/孔的密度接種于6孔板中,血清饑餓培養(yǎng)24 h后,分為HSF+PBS組、HSF+ExoADSCs組、HSF+ ExoADSCs/miR-NC組和HSF+ExoADSCs/miR-34a組,分別加入含有不同外泌體及等量PBS溶液的新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞進行后續(xù)檢測。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-34a的表達水平 采用TRIzol法提取各組ADSCs細(xì)胞及其外泌體總RNA,分光光度計測量RNA純度。采用逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄到cDNA,根據(jù)SYBR綠色熒光實時定量PCR試劑盒說明書,進行PCR檢測。其中所用引物為miR-34a:forward 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGAACAACCA-3′;reverse 5′-ACACTCCAGCTGGGTGGCAG TGTCTTAGCTG-3′;U6:forward 5′-CTCGCTTCGCAGCACA-3′;reverse 5′-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件:94 ℃、2 min,94 ℃、15 s,60 ℃、15 s,72 ℃、30 s(40個循環(huán))。以U6為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達。

1.2.6Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白的表達水平 采用不同外泌體處理HSF細(xì)胞48 h,棄培養(yǎng)基,收集各組細(xì)胞,采用RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞后,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后取上清液,使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。高溫變性后取25 μg蛋白上樣,用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后,加入一抗體兔抗人cleaved-Caspase-3(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、COL Ⅰ(1 ∶1 000)、COL Ⅲ(1 ∶1 000)、p-Smad2(1 ∶300)、p-Smad3(1 ∶2 000)、TGF-β1(1 ∶100)、CD81(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶結(jié)合二級抗體(1 ∶10 000)常溫孵育2 h,使用ECL化學(xué)發(fā)光法對蛋白質(zhì)進行化學(xué)發(fā)光,顯影和定影,將得到的膠片進行拍照后用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶。

1.2.7MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期HSF細(xì)胞,以2×103個/孔的密度接種于96孔板中,每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長至70 %融合度時,采用不同外泌體處理的HSF細(xì)胞48 h,棄培養(yǎng)基,將10 μl MTT(0.5 mg/ml)加入各孔中孵育4 h,去除上清液,加入200 μl DMSO終止反應(yīng)。將細(xì)胞在37 ℃下再培養(yǎng)15 min,使用Bio-Rad酶標(biāo)儀在c490 nm波長處檢測每個孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期HSF細(xì)胞,以2×104個/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞生長至70%融合度時,采用不同外泌體處理HSF細(xì)胞48 h,棄培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞后,胰酶消化并收集細(xì)胞,200 r/min離心5 min,棄上清液后重懸細(xì)胞,加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶(propidium lodide,PI)混勻,室溫避光孵育10 min,200 r/min離心5 min,棄上清液,加入0.5 ml PBS重懸,立刻用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的鑒定流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖1A)顯示,ADSCs的表面抗原CD90、CD105呈陽性表達,而CD31、CD45呈陰性表達。將ADSCs進行成骨誘導(dǎo)后,茜素紅染色結(jié)果可見大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)(圖1B),堿性磷酸酶染色結(jié)果可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍色沉淀(圖1C)。說明,ADSCs分離成功。

2.2 ADSCs外泌體的鑒定經(jīng)透射電子顯微鏡掃描顯示,發(fā)現(xiàn)大部分呈雙層膜結(jié)構(gòu)的圓形或橢圓形囊泡狀小體,直徑為50~100 nm(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示,與細(xì)胞溶解物比較,所提取物質(zhì)中外泌體特異性表達標(biāo)志物CD63和CD81高表達(圖2B)。結(jié)果表明,所提取物質(zhì)為外泌體。

圖1 ADSCs的鑒定

圖2 ADSCs外泌體的鑒定

A:透射電鏡顯微鏡觀察ADSCs外泌體 Bar scale=100 nm,×140 000;B:Western blot法檢測ADSCs的細(xì)胞裂解物和外泌體中CD81和CD63蛋白的表達水平

2.3 慢病毒感染后ADSCs及其外泌體中miR-34a表達水平比較qRT-PCR結(jié)果顯示,與ADSCs和ADSCs/miR-NC組比較,ADSCs/miR-34a組的miR-34a的表達水平升高(F=198.600,P<0.05);與ExoADSCs和 ExoADSCs/miR-NC組比較,ExoADSCs/miR-34a組的miR-34a的表達水平升高(F=139.700,P<0.05)。見圖3。

1.市場主導(dǎo)原則。按照市場規(guī)律,在線上線下互動創(chuàng)新發(fā)展中發(fā)揮市場配置資源的基礎(chǔ)性作用,尊重企業(yè)的市場主體地位,并充分相信轄區(qū)企業(yè)和企業(yè)經(jīng)營者的智慧,尊重企業(yè)“+電子商務(wù)”的自主經(jīng)營權(quán)。

圖3 ADSCs與外泌體的miR-34a的表達水平

A:慢病毒感染ADSCs后miR-34a的表達水平;B:慢病毒感染ADSCs后,其外泌體中miR-34a的表達水平;1:ADSCs;2:ADSCs/miR-NC;3:ADSCs/miR-34a;a:ExoADSCs;b:ExoADSCs/miR-NC;c:ExoADSCs/miR-34a;與ADSCs或ADSCs/miR-NC組比較:*P<0.05;與ExoADSCs或ExoADSCs/miR-NC組比較:#P<0.05

2.4 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF增殖能力的影響MTT 24、48、72 h結(jié)果顯示,HSF+PBS組、HSF+ExoADSCs組、HSF+ExoADSCs/miR-NC組和HSF+ExoADSCs/miR-34a組細(xì)胞組間增殖能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=108.721,P<0.05;F=206.433,P<0.05;F=213.148,P<0.05);與HSF+PBS組比較,HSF+ExoADSCs組HSF細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05);與HSF+ExoADSCs和HSF+ ExoADSCs/miR-NC組比較HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細(xì)胞增殖能力的影響

與HSF+PBS組比較:*P<0.05;與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較:#P<0.05

2.5 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細(xì)胞凋亡的影響如圖5、6所示,與HSF+PBS組比較,HSF+ExoADSCs組 HSF細(xì)胞凋亡率升高,促凋亡蛋白cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平也升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);與HSF+ExoADSCs和HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較,HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細(xì)胞凋亡率升高,cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平也升高,而Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。

2.6 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF纖維化及TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示,與HSF+PBS組比較,HSF+ExoADSCs組HSF細(xì)胞COL Ⅰ、COL Ⅲ、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05);與HSF+ExoADSCs和HSF+ ExoADSCs/miR-NC組比較,HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細(xì)胞COL Ⅰ、COL Ⅲ、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05),見圖7。

3 討論

脂肪組織廣泛分布于人體內(nèi),在生理狀態(tài)下對鄰近的軟組織起著重要的支持和保護作用。同時,脂肪組織作為一種活躍的內(nèi)分泌器官,也是新陳代謝、生長發(fā)育、抗感染等生物學(xué)過程中的關(guān)鍵因素。自體脂肪移植用于復(fù)雜的傷口修復(fù),在整形手術(shù)中也常用于軟組織再生,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,在軟組織創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[6]。但其作用機制尚不清楚。目前加速愈合和減少瘢痕形成的傳統(tǒng)方法包括皮膚移植[7]、激光治療[8]和局部應(yīng)用一些生長因子[9]。然而,這些方法可能導(dǎo)致萎縮性瘢痕、色素異常、皮膚壞死等不良后果[10]。此外,局部注射因子很容易被體液降解,并且其劑量和濃度在傷口處經(jīng)常發(fā)生較大的變化[11]。因此,有必要尋找一種穩(wěn)定、有效、安全的新方法來促進軟組織創(chuàng)面的愈合。

圖5 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細(xì)胞凋亡的影響

A:HSF+PBS;B:HSF+ExoADSCs;C:HSF+ExoADSCs/miR-NC;D:HSF+ExoADSCs/miR-34a;與HSF+PBS組比較:*P<0.05;與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較:#P<0.05

圖6 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

1:HSF+PBS;2:HSF+ExoADSCs;3:HSF+ExoADSCs/miR-NC;4:HSF+ExoADSCs/miR-34a;與HSF+PBS組比較:*P<0.05;與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較:#P<0.05

外泌體中miRNAs含量豐富且參與細(xì)胞大多數(shù)生理過程。miR-34a作為腫瘤抑制子,也對心肌成纖維化具有一定作用[14]。miR-34a是硬化成纖維細(xì)胞的潛在重要生物靶點,其通過調(diào)節(jié)Smad4促進TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維化細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化和膠原分泌[14]。但在皮膚的成纖維細(xì)胞中miR-34a的作用沒有相關(guān)研究報道。已有研究[15]證實抗凋亡蛋白Bcl-2是miR-34a的功能靶點,miR-34a通過與3’-UTR結(jié)合抑制Bcl-2的表達水平,進而促進腫瘤細(xì)胞凋亡。另外,miR-34a能抑制ADSCs的成骨成脂分化,并且降低了CDKs和Cyclins等多種細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達,在細(xì)胞S期積累分裂細(xì)胞,抑制ADSCs的增殖[5]。這些研究報道從側(cè)面證明了miR-34a對ADSCs增殖凋亡以及細(xì)胞纖維化有一定的作用。本研究結(jié)果顯示,miR-34a過表達的ADSCs外泌體能有效抑制HSF的增殖,促進細(xì)胞凋亡,并且通過下調(diào)TGF-β/Smad、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達抑制HSF的纖維化和膠原合成來減少瘢痕的生成。從miRNAs水平闡述了ADSCs外泌體對瘢痕成纖維細(xì)胞的作用,對臨床上開發(fā)新的治療方案提供了有力的證據(jù)。

圖7 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細(xì)胞纖維化及TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

1:HSF+PBS;2:HSF+ExoADSCs;3:HSF+ExoADSCs/miR-NC;4:HSF+ExoADSCs/miR-34a;與HSF+PBS組比較:*P<0.05;與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較:#P<0.05.

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